李时珍自称“幼多羸疾”，常犯目疾，但初时其志向并非为医，而是希望通过科举求取功名，14岁那年考中秀才后连续三次参加乡试均落第，心灰意冷之下决心向其父李言闻学医。其间，他系统研读《神农本草经》《伤寒杂病论》《备急千金要方》等经典，救民苦难，“无论昼夜寒暑，饥渴疲劳，一心赴救”，终成一代大医。
在行医过程中，李时珍经常遇到患者抓错药、识错药的情况，有些中药在常见药物典籍中没有记载，或“舛谬差讹遗漏，不可枚数”，李时珍认为这些错误多系“盖未深加体审，惟据纸上猜度”所致，便有了重修本草的想法。李时珍虽然有心重修本草，但以一己之力完成此事困难重重。出诊过程中的一件事让李时珍下定决心重修本草。
蕲州张姓药材商人以低于正常价三分之一的优惠价格卖给王掌柜一棵上等整株人参，王掌柜认为蕲州不产人参，好人参价格不应该这么低，怀疑药材商人以便宜的桔梗冒充人参，但自己又无法辨别，两人一个说是诬陷一个是说假药，争执不下。李时珍的父亲李言闻验视后表示，这是一棵上等人参，并非桔梗，向两人指出人参与桔梗的区别，“观其形连皮者黄润色如防风者为人参”“桔梗体坚有心而味苦，人参体实有心而味甘”。如果不是经验丰富的医药从业者，确实很难准确区分，前代药书均没有列出二者区别，类似问题困扰了不少药商、药铺。李时珍想，若有药书详注，何至于闹出这些事，遂下定决心重修本草。
李时珍认为，“本草一书关系颇重，若谬误过多，贻害众生。今人承人先贤，理应再进一步。”本着“不厌详悉”的原则，立言破惑，李时珍“渔猎群书，搜罗百氏，凡子史经传声韵，农圃医卜星相乐府，诸家稍有得处辄著有数言。”“岁历三十稔，书考八百余家，稿凡三易。”万历十八年（1590年），52卷、近190万字的《本草纲目》终于完成。
《本草纲目》对传统药典体例进行了创新，是首次将纲目分类体系引入本草领域，其以“每药标正名为纲，附释名为目，正始也。次以集解、辨疑、正误，详其土产形状也。次以气味、主治、附方，著其体用也。”做到了纲举目张，井井有条。该书经当时大儒王世贞作序后得已出版。
王世贞认为，《本草纲目》“博而不繁，详而有要，综核究竟，直窥渊海……实理性之精微，格物之通典，帝王之秘录，臣民之重宝！”此书出版时李时珍已辞世，担任四川蓬溪知县的李时珍长子李建元在《进〈本草纲目〉疏》中如是记载：“甫值刻成，忽值数尽。”