第二十章 脱落细胞检查技术
脱落细胞检验医生除要熟练掌握细胞形态学特点外，还必须掌握各项操作和染色技术及观察方法，所以脱落细胞学检查技术是重要的学习内容之一。它包括标本采集、制片、固定和染色、镜下观察方法及诊断要领等。
第一节 标本采集和涂片制作方法
一、标本采集
正确地采集标本是细胞学诊断的基础和关键之一，故要准确地选择部位，尽可能在病变区直接采集细胞。采集的标本必须保持新鲜，尽快制得，以免细胞自溶或腐败。尽可能避免血液、粘液等混入标本内，采集方法应简便，操作轻柔，避免病人痛苦和引起严重并发症及促进肿瘤扩散，下面介绐几种常用的标本采集方法。
（一）直视采集法
外阴、阴道、阴道穹窿、宫颈、口腔、肛管、鼻腔、鼻咽部、眼结膜及皮肤等部位，可以直接用刮片刮取、吸管吸取、刷洗、食管、胃、直肠、气管和肺内支气管则使用纤维内镜在病灶处直接刷取细胞制片。
（二）自然分泌液的采集法
1．痰液涂片检查：痰兴高采烈为支气管等呼吸的分泌物，对支气管肺癌和其它呼吸道疾病细胞学诊断具有重要价值。
2．尿液涂片检查：收集尿液中脱落的泌尿道细胞成分，作泌尿道肿瘤和某些疾病的细胞学诊断。
3．乳头溢涂片检查：用于导管内乳头状瘤和乳腺癌细胞学检查。
4．前列腺液涂片检查：采用前列腺按摩法取得分泌物，作前列腺细胞学诊断。
（三）灌洗洗
向空腔器官或腹腔、盆腔（剖腹探查时）灌注一定量生理盐水冲洗，使其细胞成分脱落于液体中，收集灌洗液离心制片，作细胞学检查。
（四）磨擦法
利用磨擦工具在病变部位磨擦，将擦取物直接涂片。常用磨擦工具有海棉磨擦器、线网套、气囊等。可分别用于鼻咽部、食管和胃部病灶的取材。
（五）针穿抽吸法
当有胸腔、腹腔、心包腔及关节腔积液时，可用针穿抽吸部分积液作细胞学检查。此外某些深部组织器官，如淋巴结、甲状腺、软组织、肝等亦可作细针穿刺吸取部分细胞进行涂片诊断。
二、涂片制作方法
（一）涂片前准备工作及涂片方法
1．涂片前准备工作
（1）保证标本新鲜，取材后尽快制片。
（2）涂操作要轻巧，避免挤压以防止损伤细胞。涂片要均匀，厚薄要适度，太厚细胞堆叠，太薄细胞过少，均影响诊断。
（3）玻片要清洁无油渍，先用硫酸洗涤液浸泡冲洗，再用75%乙酸浸泡。
（4）含蛋白质的标本可直接涂片，缺乏蛋白质的标本，涂片前先在玻片上涂薄层粘附剂，以防止染色时细胞脱落，常用粘附剂为蛋白甘油，由等量生鸡蛋白和甘油混合而成。
（5）每位患者的标本至少涂两张玻片，以避免漏诊。涂片后立即在玻片一端标上编号。
2．涂片制备方法
（1）推片法：用于稀薄的标本，如血液，胸、腹水等。取离心后标本一小滴滴在玻片偏右侧端，用推片用30度夹角将玻片上检液轻轻向左推。
（2）涂抹法：适用于稍稠的检液，如鼻咽部标本。用竹棉签在玻片上涂布，由玻片中心经顺时针方向外转圈淫抹；或从玻片一端开始平行涂抹，涂抹要均匀，不宜重复。
（3）压拉涂片法：将标本夹于横竖交叉的两张玻片之间，然后移动两张玻片，使之重叠，再边压边拉，获得两张涂片。该法适用于较粘稠标本，如痰液。
（4）吸管推片法：用吸和将标本滴在玻片一端，然后将滴管前端平行置于标本滴上，平行向另一端均速移动滴管即可推出均匀薄膜。此法亦适用于胸、腹水标本。
（5）喷射法：用配细针头的注射器将标本从左至右反复均匀地喷射在玻片上，此法适用于各种吸取的液体标本。
（6）印片法：将切取的病变组织用手术切开，立即将切面平放在玻片上，轻轻按印。此方法为活体组织检查的辅助方法。
（二）涂片的固定
固定（fication）的目的是保持细胞自然形态，防止细胞自溶和细菌所致的腐败；固定液能沉淀和凝固细胞内蛋白质和破下细胞内溶酶体酶，使细胞不但保持自然形态，而且结构清晰，易于着色。因此标本愈新鲜，固定愈及时，细胞结构愈清晰，染色效果愈好。
1．固定液：细胞学检查常用的固定液有下列三种：第一种乙醚酒清固定液：该固定液渗透明性较强，固定效果好适用于于一般细胞学常规染色；二种是氯仿酒精固定液：又称卡诺氏固定液。其优点同上；第三种95%酒精固定液：适用于大规模防癌普查。制备简单。但渗透作用稍差。
2．固定方法
（1）带湿固定：涂片后未待标本干燥即行固定的方法称带湿因定。此法因定细胞结构清楚，染色新鲜。适用于巴氏或HE染色。痰液、阴道分泌物及食管拉网涂片等常任常用此方法。
（2）干燥因定：涂片后未待其自然干燥，再行固定。适用于稀薄标本如尿液、胃冲洗液等，也适用于于瑞特染色和姬姆萨染色。
3．固定时间：一般为15-30min。含粘液较多标本，如痰液、阴道分泌物、食管拉网等因定时间在适当延长；尿液、胸、腹水等涂片不含粘液，固定时间可酌情缩短。
（三）涂片的染色
1．染色的目的和原理：染色的日的是借助于一种或多种染料，使组织和细胞内结构分别着不同的染色，这样在显微镜下能清楚地观察细胞内部结构，作出正确判断。
组织细胞染色原理至今尚无满意的解释，可能是物理作用，也可能是化学作用，或者是两者综合作用的结 果。
染色的物理作用是利用毛细管现象，渗透、吸收和吸附作用，使染料的色素颗粒牢固地进入组织细胞，并使其显色。
染色的化学作用是渗入组织细胞的染料与其相应的物质起化学反应，产生有色的化合物。
各染料都具有两种性质，即产生颜色；征收被组织形成亲和力。这两种性质主要由发色基因和助色基因所产生的。
发色基团：苯的衍生物具有可见光区吸收带。这些衍生物显不的吸收带与其价键的不稳定性有关，如对苯二酚为无色，当其氧化后失去两个氢原子，它的分子或则变为有黄色的对醌，这种产生颜色的醌式环称为发色基团。若一种化合物含有几个环，只要其中有一个醌式环就会发出颜色，称此发色基团为色原（chromogen）.
助色基团：是一种能使化合物以生电离作用的辅助原子团（酸碱性基团）。它能使染色的色泽进一步加深，并使其与被染色组织具有亲和力。
助色基团的性质决定染料是酸性碱性。碱性染料具有碱性助色基团，在溶媒中产生的带色部分为带正电荷的阳离子，吻与组织细胞内带负电荷的物质结合而显色。如细胞核内的主要化学成分脱氧化核糖核酸易被苏木素染成紫蓝色，称嗜碱性。酸性染料具有酸性用力色基团，在溶酶中产生带色部分为阴离子，易与组织细胞内带正电荷部分结合而显色，此性质被称为嗜酸性，如细胞浆内订成分为蛋白质，易与伊红或橘黄结合呈红色或橘黄色。
2．常用染色方法：临床日常工作中较为常用的染色方法有下列3种：
（1）巴氏染色法：本法染色特点是细胞具有多色性颜色，色彩鲜艳多彩。涂片染色的透明性好，胞质颗粒分明，胞核结构清晰，如鳞状上皮过度角化细胞胞质呈橘黄色；角化细胞显粉红色；而角化前细胞显浅绿色或浅蓝色，适用于上皮细胞染色或观察阴道涂片中激素水平对上皮细胞的影响。此方法的缺点是染色程序比较复杂。
（2）苏木精—伊红（hemotoxylin eosin,HE）染色法：该方法染色透明度好，核与胞质对比鲜明。染色步骤简便，效果稳定。适用于痰液涂片，觖质核呈紫蓝色，胞质淡玫瑰红色，红细胞呈淡朱红色。
（3）瑞特—吉姆萨染色法（wrightgiemsa atain）；本方法多用于血液，骨髓细胞学检查。胞质内颗粒与核安危质结构显示较清晰。操作简便。
第二节 涂片的观察与诊断
一、涂片观察的方法
为提高诊断率和防止造成差错，检查涂片前必须严格核对涂片编号，了解送检单上填写的全部资料；阅片要全面、认真、细心观察。
因涂片中细胞成分分布极为分散，所以显微镜观察时必须按顺序视全张涂片，用推进器从左至右。自上而下移动，仔细观察每一个视野，归后将盖片边缘亦做仔细检查，经防止漏诊（图20-1）。
图20-1 观察切片的移动法
A错误的玻片移动法
B正确的玻片移动法
涂片细胞学检查十分重视低倍观察，先宏观涂片中各种细胞成分，发现异常细胞时，再转换高倍视野，仔细观察细胞结构，明确性质，做出正确诊断。
二、提高细胞学诊断率的要领
（一）细胞学诊断的书写方式
细胞学检查癌细胞的诊断方式分为直接法和分级法。
1．直接法：根据细胞学检查结果，直接写出关于疾病的诊断如痰抹片检查结果为“俩支气管鳞癌”。
2．分级法：将涂片中细胞学检查发现的细胞变化，用分级方式表示。它的优点是能真实地反映细胞学所见。较这客观。目前有三级、四级、和五级三种分类方法。五级分类法过于繁琐，实际应用中较难掌握。因此国内仍常用三级或四级分类法，该两种分类法较为简单明确，易于掌握，能够更准确地反映涂片的本质。
（1）三级分类法：将细胞学检查结果分为阴性，可疑和阳性三级。
Ⅰ级：阴性：无核异质细胞，涂片中均为正常细胞或一般退变细胞。
Ⅱ级：可疑。涂片中发现核异质细胞，但不能肯定的是肿瘤细胞，应重复送检。
Ⅲ级：阳性。涂片中发现典型癌细胞，有时根据癌细胞形态特征及分布，初步进行分类。
（2）四级分类法：将细胞学检查结果分为阴性、核异质，可疑和阳性四级。
Ⅰ级：阴性。
Ⅱ级：核异质。涂片中发现少量核异质细胞，由高度炎症增生所致。
Ⅲ级：可疑。涂片中见重度核异质细胞，其形态基本符合恶性肿瘤细胞标准，但数量过少，还不能完全排除癌前期病变或高度炎症坟生的可能，建议临床重复送检。
Ⅳ级：阳性。
（3）五级分类法
Ⅰ级：无核异质细胞。
Ⅱ级：少量轻度核异质细胞，但无恶性证据。
Ⅲ级：有较多重度核异质细胞，但不能肯定为恶性。
Ⅳ级：有大量重度核异质细胞，但仍缺乏典型恶性肿瘤细胞的证据。
Ⅴ级：发现典型恶性肿瘤细胞，根据其细胞形态，作出初步的分类。
（二）提高细胞学诊断的要领
1．熟练掌握病理学：脱落细胞来自组织，所以是病变组织的部分反映，具有踏实的病理学基础，才能对千变万化的脱落细胞形态作出正确的判断。
2．多思考、多比较：涂片中细胞成分，背景成分以及细胞变性程度等每例各不相同，阅片时要分析思考和比较，最好用涂片中某一背景成他，如淋巴细胞或红细胞作标本。
3．密切结合临床：多与临床医生联系，了解临床症状，化验及影像诊断结果，避免盲目性。
4。认识脱落细胞学的局限性：无充分证据，宁可保存守一点。未肯定的报告对临床亦有参考价值。
5．了解各种染色的特性和优缺点因不同染色方法，细胞表现差别很大。
（三）细胞学诊断的误诊原因
细胞学诊断误诊造成临床诊断的错误，以致影响对患者疾病的诊断治疗。误诊形式有假阳性和假阴性两种。前者是在非肿瘤患者涂片中找到所谓的癌细胞；后者是在肿瘤患者涂片内未找到癌细胞。
细胞学检查从取材到最后诊断，任何一个步骤处理不当，均可产生误诊。引起的误诊原因有以下几种：
1．标本取材不当：未取到真有癌细胞部分，如痰液制片时未仔细选择有效病理成分；或患者咳痰方式不对，未采集到支气管深部分泌物等。
2．标本不新鲜：细胞学检查标本必须在采集后1-2小时内涂片，立即固定，以防止细胞自溶。
3．编号错误：会发生误诊嘏造成医疗事故。故送检标本、申请单、涂片、报告单编号后应仔细核对，避免出现差错。
4．细胞污染：涂片在固定和染色过程中，不断有细胞脱落于试剂中，这些细胞有可能粘附在其它患者涂片上而造成误诊，故要经常过滤或现换试剂。
5．观察不仔细或方法不正确而发生的漏误。
6．肿瘤细胞分化好，与正常细胞不易区别。
7．经放疗或化疗后，正常上皮细胞受射线作用，有明显的形态学改变，吻误诊为癌细胞。