第一节 胆固醇测定
血清中胆固醇包括CE和FC，酯型的CE占70%，FC占30%。CE中的C3的-OH在LCAT作用下，可分别结合亚油酸（43%）、油酸（24%）、软脂酸（10%）、亚麻油酸（6%）、花生四烯酸（6%）、硬脂酸（3%）等脂肪酸结合而成。血清中胆固醇在LDL中最多，其次是HDL和VLDL、CM最少。血清总胆固醇测定方法分为化学法和酶法两大类。
1．化学法
化学法一般包括：①抽提；②皂化；③毛地黄皂苷沉淀纯化；④显色比色四个阶段。代表性的方法有Sperry-Webb法，通过①～④步骤操作过程。常规操作中多采用省去了②、③。或者用省去②、③步骤的Zak-Henly法及省去③步骤的Abell-Kendall法，现将此法作为标准参考方法予以引用。
2．酵法测定
CE在胆固醇酯酶（cholesterolesterase）作用下水解成FC和NFFA，TC再经胆固醇氧化酶（cholesterol oxidase,COD）氧化成△4胆甾烯酮和H2O2。再分别定量O2的消耗或者H2O2的生成量，或者△4胆甾烯酮生成量,以作为TC的定量依据。该法是目前常规的应用方法，快速准确，标本用量少，便于自动生化分析仪作批量测定。
一、Abell-Kendall改良法
1．原理
血清加入醇溶性氢氧化钾，使胆固醇从脂蛋白中分离出来，同时使胆固醇酯加水分解成游离胆固醇，加石油醚振摇、抽提，使胆固醇移入石油醚层，分离并取一定量的石油醚层，蒸发至干，再进行Liebermann-Burchard 显色反应，620nm比色定量。该法可用于基本功训练及组织细胞胆固醇的提取定量。
2．试剂组成
| 代号 | 种类 | 浓度 | 组 成 | 贮存2～8℃ | 有效时间 |
| R1 | 乙醇 | 优质纯 | |||
| R2 | 石油醚 | 沸点68℃，特级纯 | |||
| R3 | 水醋酸 | 分析纯 | |||
| R4 | 无水醋酸 | 胆固醇分析用，不含HCI | |||
| R5 | 浓硫酸 | 分析纯 | |||
| R6 | KOH液 | 33%(W/W) | KOH10g+H2O20ml | ||
| R7 | 乙醇性KOH液 | R194ml+R66ml | 临用前配制 | ||
| R8 | Liebermann | 配制后 | |||
| Burchard | R420体积+R51体积+R310体积 | 1h | |||
| 试剂* | 内用完 | ||||
| R9 | 胆固醇标准液 | 5.17mmol/L | 胆固醇标准品200mg+R1→100ml | 0 |
*：在三角烧瓶内，加入无水醋酸，于冰水中冷至10℃以下，再慢慢加入浓硫酸，混合，静置10min，又加冰醋酸混匀，备用。
3．操作
图15-1 血清胆固醇（Abell法）测定操作图
按图15-1操作。
4．计算
标准总胆固醇浓度=ESA/EST×5.17(mmol/L)
二、酶法（CEH、COD-POD法）
首先将血清中胆固醇酯在胆固醇酯酶（CEH）水解为游离胆固醇和脂肪酸，胆固醇在胆固醇氧化酶（COD）作用下，生成△4-胆甾烯酮和H2O2，再H2O2经过氧化物酶（POD）作用在4-氨基安替比林（4-AA-P）及N-乙基-N-（3-磺基醋酸）-3甲氧基苯胺（N-ethyl-N-(3-sulfopropyl)-manisidine,ESPAS）参与下，生成红色醌亚胺色素。
H2O2+ESPAS+4-氨基安替比林→红色醌亚胺色素
（一）手工测定法
1．试剂组成
| 代号 | 种类 | 浓度 | 组成 | 贮2～8℃ | 有效时间 |
| Na2HPO4 | 50mmol/L | ||||
| Na2H2PO4 | 50mmol/L | ||||
| 胆酸钠 | 3mmol/L | ||||
| 4-氨基安替比林 | 0.82mmol/L | ||||
| R1* | ESPAS | 14mmol/L | 24h | ||
| Carbowax-6000 | 0.17mmol/L | ||||
| CEH | 33U/L | ||||
| COD | 117U/L | ||||
| POD | 6700U/L | ||||
| R2 | 标准液 | 5.17mmol/L | 用异丙醇溶解胆固醇 |
*混匀，调pH至6.70±0.10(25℃)，或购买试剂盒。酶以活性单位表示。
2．操作
按图15-2操作。
3．计算
标准总胆固醇浓度=ESA/EST×5.17(mmol/L)
（二）自动化分析仪测定
以CL-7200型全自动生化分析仪检测为例。
1．试剂组成
A液：CEH、POD、抗坏血酸氧化酶等。
B液：COD、4-氨基安替比林等。
图15-2 血清胆固醇测定（酶法）操作图
2．上机参数
| 项 目 | 参 数 |
| 方 法 | 终点法 |
| 波 长 | 双波长（540nm，700nm） |
| 反应温度 | 37℃ |
| 试剂A反应时间 | 2～3min |
| 试剂B反应时间 | 5～6min |
| 样本用量 | 3μl |
| 试剂A用量 | 250μl |
| 试剂B用量 | 120μl |
| 单位 | mmol/L |
3．操作过程
4．计算
以△A=A2-A1，根据同样处理之标准或质控物计算，打印结果。
5．注意事项
（1）试剂与样本量可根据分析仪要求按比例改变。
（2）试剂在有效内2～8℃避光食保存。
（3）胆固醇含量超过200mmol/L，需用生理盐水稀释再测。