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 《中国生物制品规程》 > 吸附百日咳菌苗、白喉、破伤风类毒素混合制剂制造及检定规程

附录2 百日咳菌苗原液免疫力试验方法

1 免疫

1.1 动物

选用体重10~12g同性或雌雄性各半的健康NIH小白鼠。

将动物随机分为三组,每组16只或20只(同性或雌雄性各半,为保证攻击后有16只或20只小白鼠,可适当多免疫几只小白鼠),同时饲养健康小白鼠55只,备做对照用。

1.2 免疫原稀释

将百日咳原液用生理盐水或pH7.3±0.1磷酸盐缓冲生理盐水稀释至成品菌苗浓度的1/2,然后再稀释7.5×、37.5×、187.5×,百日咳参考菌苗稀释至每ml含8IU,然后再稀释成每ml含1.0IU(0.125ml)、0.2IU(0.025ml)及0.04IU(0.005ml)。

1.3 免疫方法

将不同稀释度的免疫原分别免疫小白鼠,每只小白鼠各腹腔注射0.5ml。

2 攻击菌及攻击菌液的制备

2.1 菌种

小白鼠脑内攻击用58030(18323)菌株。

2.2 培养基

可用包-姜氏培养基(含羊血20%~30%)或其他适宜的培养基。

2.3 培养温度及时间

放35~37℃培育,第一代不超过72小时,攻击时菌种的培育时间为20~24小时。原代菌种放2~8℃可保存2周。

2.4攻击菌液的制备

将培育20~24小时的菌苔经肉眼检查为纯菌后,刮入生理盐水或pH7.3±0.1缓冲生理盐水,用灭菌脱脂棉过滤,测定浓度,然后用pH7.0~7.2水解酷素、蛋白胨水或肉汤稀释成每0.03ml含菌8万,作为试验组的攻击菌液,然后再连续稀释,使每0.03ml分别含8000、800、80及8个菌,以上5个不同稀释度的菌液,作为对照组的攻击菌液。

2.5 工作起止时间

自攻击菌液制备(开始刮菌)至注射完最后1只小白鼠不得超过2.5小时。

2.6活菌计数

在攻击前后,可将0.03ml含8个菌的攻击菌液,接种于包一姜氏培养基或其他适宜的培养基平皿中,每个平皿0.2ml,每次不得少于2个平皿,其菌落形成单位约为浊度测定的1/4。

3 攻击

动物免疫后14天,每只小白鼠脑内攻击0.03ml菌液(含8万个菌),用0.25ml注射器,4号针头。在试验组攻击后再进行对照组毒力测定,对照组每稀释度攻击10只小白鼠。

4 记录结果

动物攻击后观察14天。攻击后第2天,将试验组动物处理成每组16只或20只。以后逐日观察动物并记录死亡数,最初3天死亡的动物不作统计,至第14天有麻痹、头部肿胀、弓背及明显耸毛的动物按死亡计算。

5 结果计算

5.1 按Wilson-Worcester氏法计算参考菌苗及待检菌苗的ED50±SD%,每个ED50标准差的范围一般应为64%~156%。

5.2 按Reed-Muench氏法计算对照组LD50,1个LD50的菌数应不高于800个菌。

5.3 计算均质性因子“α”。

5.4IU计算

待检原液每ml应含IU=参考菌苗ED50/待检原液ED50×参考菌苗每ml的IU数

6 效力评价

百日咳原液按成品菌苗尝试稀释后,每个接种剂量的免疫效价应不少于4.0IU。