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 《中国幽门螺杆菌研究》 > 2.幽门螺杆菌的基础实验研究

大鼠实验性幽门螺杆菌感染

研究表明,幽门螺杆菌(Helicobacterpylori,Hp)与胃炎、消化性溃疡等胃部疾患密切相关,为此,我们对某些实验性动物进行实验,结果发现Wistar大鼠经口感染Hp,可导致实验性感染。从其胃组织中检查到并分离出Hp,粘膜组织亦显示某些病理变化。从而为研究Hp实验性感染提供较为合适的一种动物模型。

1 材料和方法

1.1 菌株 幽门螺杆菌Hp379及Hp404株,系北京市积水潭医院消化内科就诊的胃病患者,经由内窥镜取得的胃粘膜进行细菌培养分离到的。经过鉴定,由本室传代保存。

1.2 动物 Wistar大鼠,购自中国医学科学院实验动物研究所。新西兰种家兔,C57和BALB/小鼠,由本所动物室供给。

1.3 感染方法 Wistar大鼠的实验分2次进行。第1次用出生5个月(体重175g~254g)的成年鼠,第2次用出生两个月(体重152g~174g)的幼龄鼠。动物先禁食12h~14h,用胃管喂以5%Na2HCO32ml,15min后用胃管注入Hp379或Hp404株的菌液1.5ml(1010CFU/ml,30min后给食。每周感染1次,共4次。对照组动物不感染Hp,饲养条件与实验组相同。用以感染的家兔为幼龄兔(体重1200g~1500g)。C57小鼠为4周龄幼鼠(10g~12g),BABL/C用成年鼠(18g~20g)。感染方法同大鼠,家兔每次感染量为2ml,小鼠为0.5ml(1010CFU/ ml),每周感染1次,共5次。动物在最后1次感染后的第7d~10d,禁食12h~14h后,乙醚麻醉处死,无菌操作取出胃,用灭菌PBS洗去胃内容物,从靠近幽门端的不同部位剪取胃粘膜3~4小块,加含10%小牛血清的布氏肉汤2ml,用组织研磨器制成浆,用以做尿素酶试验,直接涂片检菌和细菌培养。其余的胃组织用10%甲醛(PBS配制)固定,供病理学检查。

1.4  细菌学检查 ①尿素酶试验基本参考Morris等的方法。②胃粘膜直接涂片检菌法:取粘膜匀浆滴推成涂片,用甲醇固定10min,0.3%碱性复红染色,镜检Hp菌。③Hp菌培养:以布氏琼脂为基础,加入6%脱纤维羊血及脱氧胸苷酸(TMP)5mg/L,万古霉素6mg/L,两性霉素2mg/L,制成血平板后,置4°C保存备用。取胃粘膜匀浆0.2ml于血平板后,涂匀后放入含10%CO2、5%O2及85%N2的混合气体培养箱中,57°C培养72h后观察结果。

1.5 病理学检查  甲醛固定的胃组织,石蜡包埋,切成6μm厚的组织切片。分别用苏木素-伊红和Warthin-Starry镀银染色,观察病理改变和检查组织切片中的Hp。

2 结果

2.1 尿素酶试验 经口感染Hp的8只大鼠,其胃粘膜做尿素酶试验,多数在4h内,个别的24h出现阳性反应。对照组大鼠的胃粘膜呈阴性反应。经哭喊Hp的家兔、C57和BALA/C小鼠的胃粘膜,均呈阴性反应。

2.2  涂片细菌检查  感染Hp的8只大鼠的胃粘膜匀浆,制成涂片染色后镜检,均检查到Hp。未感染的大鼠胃粘膜涂片未找到Hp。感染Hp的兔、C57和BALB/C小鼠的胃粘膜涂片亦未检查到Hp。

2.3 细菌培养 各组动物的胃粘膜组织都做了Hp培养,结果只有感染Hp的大鼠胃组织,分离出Hp。其他各组均款培养出Hp。

2.4 组织切片细菌检查 胃粘膜组织切片用Warthin-Starry染色,背景为淡黄色,Hp染色成黑色。感染Hp的大鼠,无论是幼龄鼠或是成年鼠,其胃粘膜切片中均可找到Hp,它们主要分布于粘液层。粘膜上皮细胞的表面和粘膜的隐窝处。切片中的Hp形成呈半圆、S或螺旋状,未感染Hp的正常大鼠,胃组织中未找到Hp。感染Hp 的家兔、C57和BALB/C小鼠的胃切片中,亦未检到Hp。

2.5 病理组织学检查 感染Hp大鼠的胃组织切片中,可见粘膜上皮细胞变性病灶,细胞肿胀而变得不规则,胞浆内结构不清或消失。粘膜层见有单个核细胞浸润病灶。

3 讨论

上述结果表明Wistar大鼠对Hp易感。经口感染Hp,可从其胃粘膜中检查到并分离出Hp,胃粘膜亦出现病变。与之相反,家兔、C57和BALB/C小鼠,示能引起Hp的实验性感染。Ehler曾用Lewis大鼠,C57BL/6和BALB/C小鼠做实验,试图建立Hp的动物模型,未获成功。他们的小鼠实验结果与我们的结果相同,都是阴性。但大鼠的实验结果不同。可能是因为实验条件不同的缘故。

自从1983年首先从人胃中分离到Hp以后,相继从水貂和恒河猴的胃组织中分离出Hp样细菌。那么,我们从感染的Wistar大鼠胃组织中分离到的Hp是否亦是自然存在的呢?看来,这种可能性不大。因为,如前所述,未感染的对照组大鼠,用各种方法检测,都没有检查到Hp菌

最近报道悉生仔猪经口感染Hp,可从胃组织中分离出Hp。但用悉生仔猪做实验,不但费用昂贵,而且不方便。根据本实验结果,我们认为Wistar大鼠,尤其是幼龄鼠,是研究Hp菌较为理想的动物模型。但是,多次感染是必要的。

 

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