首页\中医书籍\西医备考\《实用免疫细胞与核酸》\
 《实用免疫细胞与核酸》 > 第十九章 核酸(基因)分子探针

第五节 寡核苷酸探针的制备

利用寡核苷酸自动合成仪,可很简单地合成制备寡核苷酸探针(如15~50bp),这类探针具有以下优点:①短的探针比长探针杂交速度快,特异性强。②可以在短时间内大量制备。③在合成中进行标记制成探针。④可合成单链探针,避免了用双链DNA探针在杂交中自我复性,提高杂交效率。⑤寡核苷酸探针可以检测小DNA片段,在严格的杂交条件下,可用于检测在序列中单碱基对的错配。

因此,寡核苷酸探针的研究,对于提高核酸杂交技术的特异性和敏感性,扩大应用范围有重要意义。

常用的寡核苷酸探针有3种:①特定序列的单一寡核苷酸探针;②较短的简并性较高的成套寡核苷酸探针;③较长而简并性较低的成套寡核苷酸探针。多用32P标记寡核苷酸探针,如:1)通过T4噬菌体多核苷酸激酶催化的磷酸化反应标记合成的寡核苷酸探针,在合成寡核苷酸时期5’端缺少一个磷酸基,因而易用T4噬菌体多核苷酸激酶进行磷酸化反应,而将α-32P从[γ-32P]ATP转移至其5’端。这种磷酸化反应最多能使每一寡核苷酸分子中掺入一个32P原子。2)用大肠杆菌DNA聚合酶i Klenow片段标记合成的寡核苷酸探针,其比活性更高,每一寡核苷酸分子可带有若干个放射性原子,放射性比活度可高达2×1010计数/(min·mg)。

DNA聚合酶i Klenow片段标记合成寡核苷酸探针

附图 DNA聚合酶i Klenow片段标记合成寡核苷酸探针

寡核苷酸探针的非放射性标记时,可用以下几种方法:

1.酶延伸法合成与探针目的基因的3’-端一段互补的寡核苷核序列,此序列的5’-端多加一个A,与目的基因片段退火,再用Klenow酶延伸,使bio –dUTP掺入探针的3’末端。

2.5’磷酸末端标记法带5’-磷酸的寡核苷酸探针,在咪唑缓冲液中用水溶性碳二亚胺(EDC)处理,可生成活性的磷酸咪唑中间体,与过量的乙二胺作用,就可以引入一个带氨基的接臂。用活化生物素标记就可以得到5’-磷酸标记的寡核苷酸探针。

3.酶标探针法用双功能联接剂如辛二酸双羟基琥珀亚胺酯联接寡核苷酸和碱磷酶,可以生成1:1的酶标寡核苷酸探针。此法省略了生物素-亲合素中间步骤,可减少非特异性反应。

4.生物素酰肼胞嘧啶修饰法在亚硫酸盐催化下,生物素酰肼可置换寡核苷酸探针中胞嘧啶上的氨基而得生物素化寡核苷酸探针。

5.寡核苷酸的酶促加尾标记法在末端转移酶的作用下,用非放射性物质修饰的核苷酸(生物素dATP;生物素-dUTP;地高辛-dUTP)可加到DNA的3’末端,每个探针DNA可加上10~20个修饰碱基。

(1)取-0.5ml硅化塑料离心管,插入冰浴中,加入寡核苷酸(3pmol)×μl,5×加尾缓冲液20μl,5.0mmol/l dUTP 4μl(终浓度200μmol/L),修饰的dNTP(生物素-dUTP;生物素-dATP;地高辛-dUTP)×μl(终浓度100μmol/L),加入至100μl,混匀后加入末端转移酶5u。37℃反应1h。

(2)探针纯化:乙醇沉淀法:加入50μg tRNA,15ul 4mol/L醋酸钠和375μl无水乙醇,混匀,-20℃1h,高速离心10min,弃上清,用70%乙醇和无水乙醇再反复洗沉淀,晾干,再溶于水中,浓度为500ng/ml。

常用试剂配制方法[见附录二“(四)关于探针的标记”部分]。

 

缂傚倸鍊搁崐鎼佸磹閻戣姤鍊块柨鏇楀亾妞ゎ偄绻楅妵鎰板箳閹惧厖鐢婚梻渚€娼чˇ顐﹀疾濞戙垺鍤嬬憸鐗堝笚閻撴瑧绱撴担闈涚仼闁哄鍠栭弻娑欐償閿熺姴寮伴梺鍝勭灱閸犳挾妲愰幒妤€顫呴柣妯虹-娴滄劙姊绘担鍛靛綊顢栭崱娑樼闁归棿绶ょ紞鏍ㄧ節闂堟侗鍎愰柟顖滃仦閵囧嫰骞囬埡浣插亾濡も偓閳绘棃鏁撻敓锟�

婵犵數濮烽。钘壩i崨鏉戠;闁规崘娉涚欢銈呂旈敐鍛殲闁稿顑夐弻锝呂熷▎鎯ф閺夆晜绻堝铏规崉閵娿儲鐝㈤梺鐟板殩閹凤拷闂傚倸鍊搁崐鐑芥嚄閼哥數浠氭俊鐐€栭崹鐢稿箠閹版澘绠查柕蹇嬪€曠粻锝夋煥閺囨浜鹃梺钘夊暟閸犳牠寮婚妸鈺傚亞闁稿本绋戦锟�闂傚倸鍊搁崐鐑芥嚄閼哥數浠氱紓鍌欒兌缁垶銆冮崨瀛樺仼闁绘垼濮ら崑銊х磼鐎n偄顕滈柣搴墴濮婅櫣鎹勯妸銉︾彚闂佺懓鍤栭幏锟�闂傚倸鍊搁崐椋庣矆娓氣偓楠炴牠顢曢敃鈧壕鐟扳攽閻樺疇澹樼紒鐘靛█閺岀喖骞嗚閹界姵绻涢崨顖氣枅闁哄被鍔戦幃銈夊磼濞戞﹩浼�婵犵數濮烽弫鎼佸磻閻愬搫鍨傞悹杞扮秿濞戙垹绠i柣鎰缁犳岸姊洪幖鐐插姶闁告挻宀稿畷鏇㈠箻缂佹ḿ鍙嗛梺缁樻礀閸婂湱鈧熬鎷�婵犵數濮烽弫鎼佸磻閻愬搫鍨傞柛顐f礀缁犲綊鏌嶉崫鍕櫣闁活厽顨婇弻宥堫檨闁告挻鐩崺鈧い鎺戝枤濞兼劙鏌熺喊鍗炰喊妤犵偛绻橀弫鎾绘晸閿燂拷缂傚倸鍊搁崐鎼佸磹妞嬪海鐭嗗〒姘e亾閽樻繈鏌熷畡鐗堟拱闁瑰啿鐭傚缁樻媴閸涘﹥鍎撻梺娲诲幖椤︾敻鐛箛娑欐櫢闁跨噦鎷�闂傚倸鍊搁崐宄懊归崶顒€纾婚柟鎵閸嬨倝鏌¢崘銊у闁搞劌鍊块弻鈩冨緞鐎e墎绌块悷婊呭鐢寮查幖浣圭叆闁绘洖鍊圭€氾拷闂傚倸鍊搁崐鐑芥倿閿曞倹鍎戠憸鐗堝笒绾惧綊鏌″搴″箲闁逞屽墮閸熸潙鐣烽崡鐐╂瀻闁归偊鍓欓獮鎴︽⒒娴h姤纭堕柛锝忕畵楠炲繘鏁撻敓锟�闂傚倸鍊搁崐宄懊归崶顒€纾婚柟鎵閸嬨倝鏌¢崘銊у闁搞劌鍊垮娲敆閳ь剛绮旈幘顔藉珔闁绘柨鍚嬮悡銉╂煟閺囩偛鈧湱鈧熬鎷�闂傚倸鍊搁崐椋庣矆娓氣偓楠炴牠顢曢敃鈧壕褰掓煕濠靛嫬鍔ょ紒鈧繝鍌楁斀闁绘ɑ褰冮埀顒傛暬瀵悂寮介鐔哄弳闂佺粯娲栭崐鍦偓姘炬嫹闂傚倸鍊峰ù鍥х暦閻㈢ǹ绐楅柟鎵閸嬶繝鏌曟径鍫濆壔婵炴垶菤閺€浠嬫倵閿濆啫濡烽柛瀣崌瀹曟帡鎮欑€涙ɑ顏熼梻浣芥硶閸o箓骞忛敓锟�缂傚倸鍊搁崐鎼佸磹妞嬪海鐭嗗〒姘e亾闁诡垰顦甸幊鏍煛閸屾艾绨ユ繝鐢靛█濞佳囨偋韫囨洜鐭嗗┑鐘叉处閻撱儵鏌i弴鐐测偓鍦偓姘炬嫹闂傚倸鍊搁崐椋庣矆娓氣偓楠炲鏁撻悩鑼槷闂佸搫娲㈤崹鍦不閻樼粯鐓欓柡澶婄仢缁ㄨ崵绱撳鍡欏⒌闁哄被鍔戦幃銈夊磼濞戞﹩浼�婵犵數濮烽弫鍛婃叏娴兼潙鍨傚┑鍌溓归弰銉╂煛瀹ュ骸骞楅柛瀣儐缁绘繃绻濋崒婊冣拪缂傚倸绉甸悧鐘诲蓟閵娾晜鍋嗛柛灞剧☉椤忥拷婵犵數濮烽弫鍛婃叏閻戝鈧倹绂掔€n亞鍔﹀銈嗗笒閸燁垶鎮甸鍡忓亾閻熺増鍟炵紒璇插暣婵$敻宕熼锝嗘櫇濡炪倖甯婄粈渚€顢旈敓锟�闂傚倸鍊搁崐鐑芥倿閿曞倹鍎戠憸鐗堝笒閸ㄥ倸霉閻樿尙鎳佸鑸靛姇缁犺霉閸忚偐鎳呯紒瀣箻濮婅櫣鎹勯妸銉︾彚闂佺懓鍤栭幏锟�闂傚倸鍊搁崐椋庣矆娓氣偓楠炲鏁撻悩鍐蹭画闁哄鐗冮弲婵堢矆婵犲洦鐓冪憸婊堝礈閻旂厧钃熸繛鎴烇供濞笺劑鏌涢銈呮瀻妞ゅ骏鎷�闂傚倸鍊搁崐椋庣矆娓氣偓楠炴饪伴崟顒€寮块梺鍦檸閸熺喖宕堕浣哄姸閻庡箍鍎辩换鎺旂矙韫囨稒鈷戦悹鎭掑妼濞呮劙鏌熼崙銈嗗 婵犵數濮甸鏍窗濡も偓閻g兘宕稿Δ鈧獮銏′繆閵堝倸浜鹃梺璇″灣閸嬨倕顫忛搹鍦煓閹煎瓨鎸搁幃宥夋⒑閻熸澘娈╅柟鍑ゆ嫹闂傚倸鍊搁崐鐑芥倿閿曗偓椤啴骞愭惔锝庢锤闂佹寧绻傞ˇ顖滃婵犳碍鐓欓柡澶婄仢缁ㄨ崵绱撳鍡欏⒌闁哄被鍔戦幃銈夊磼濞戞﹩浼�闂傚倸鍊搁崐椋庣矆娓氣偓瀹曘儳鈧綆浜堕悢鍡樹繆椤栨粌甯舵い銉︾閵囧嫰骞欓崘鈺冪獧缂傚倸绉甸悧鐘诲蓟閵娾晜鍋嗛柛灞剧☉椤忥拷闂傚倸鍊搁崐鐑芥嚄閼哥數浠氭繝娈垮枟閿曨偆绮婚幋锕€鐓濋柡鍐ㄧ墕閸楄櫕銇勯顐㈡灓缂佸绻樺铏规崉閵娿儲鐝㈤梺鐟板殩閹凤拷闂傚倸鍊搁崐宄懊归崶銊х彾闁割偒婢€閻掑﹥绻涢崱妯哄闁告瑥绻愯灃闁挎繂鎳庨弳娆戠棯閹勫仴闁哄被鍔戦幃銈夊磼濞戞﹩浼�濠电姷鏁告慨鐑藉极閹间礁纾绘繛鎴旀嚍閸ヮ剦鏁嶉柣鎰綑濞堬絽顪冮妶鍡欏缂侇喖娴风划鍫ュ礋椤栨稓鍙嗛梺缁樻礀閸婂湱鈧熬鎷�闂傚倸鍊搁崐鐑芥嚄閸洖鍌ㄧ憸宥夘敋閿濆绀堝ù锝囨嚀鎼村﹪姊虹化鏇炲⒉缂佸鍨规竟鏇㈠锤濡や胶鍙嗛梺缁樻礀閸婂湱鈧熬鎷�闂傚倸鍊搁崐鐑芥嚄閸洖鍌ㄧ憸宥夘敋閿濆绀堝ù锝堟閻撴捇姊洪崫鍕枆闁告ǹ鍋愭竟鏇熺節濮橆厾鍙嗛梺缁樻礀閸婂湱鈧熬鎷�婵犵數濮撮惀澶愬级鎼存挸浜炬俊銈勭劍閸欏繐霉閸忓吋缍戠紒鈧径鎰闁圭⒈鍘鹃崢婊呯磽瀹ュ棛澧甸柡灞诲姂閹倝宕掑☉姗嗕紦缂傚倸鍊搁崐鎼佸磹瀹勯偊娓婚柟鐑橆殕閸ゅ嫰鏌涢锝嗙缁炬儳顭烽弻锝夊棘閹稿孩鍎撻梺鎼炲妽缁诲牓寮婚妸鈺傚亞闁稿本绋戦锟�闂傚倸鍊搁崐椋庣矆娓氣偓楠炲鏁嶉崟顓犵厯闂佽宕橀褔宕掗妸褎鍠愰柡鍐ㄧ墢瀹撲線鏌涢埄鍐姇闁哄懏鎮傞弻銊╂偆閸屾稑顏�闂傚倸鍊搁崐鐑芥倿閿曗偓椤啴宕稿Δ浣镐簵闂佸壊鍋侀崕杈╃玻濡や胶绠鹃柟瀛樼懃閻忊晝鐥幆褜鐓奸柡灞诲姂閹倝宕掑☉姗嗕紦闂傚倸鍊搁崐宄懊归崶銊х彾闁割偒婢€閻掑﹥銇勮箛鎾愁仱闁哄鐗犻弻锟犲炊閳轰讲鍋撻敐澶嬫櫜濠㈣泛顑嗗▍銏ゆ⒑鐠恒劌娅愰柟鍑ゆ嫹缂傚倸鍊搁崐鎼佸磹閹间礁纾圭紒瀣紩濞差亜围闁糕檧鏅滈鏃堟⒑瑜版帗锛熺紒璁圭節瀵偅绻濋崶銊у弳闂佺粯娲栭崐鍦偓姘炬嫹婵犵數濮烽弫鎼佸磿閹寸姴绶ら柦妯侯棦濞差亝鏅滈柣鎰靛墮鎼村﹪姊虹粙鎸庢拱缂佸鎹囬妴鍛存倻閼恒儳鍙嗛梺缁樻礀閸婂湱鈧熬鎷�闂傚倷娴囬褍霉閻戣棄纾婚柨婵嗩槸绾捐绻涢幋鐐冩岸寮搁弽銊х闁瑰瓨鐟ラ悞娲煛娴e壊鍎旈柡灞诲姂閹倝宕掑☉姗嗕紦闂傚倸鍊搁崐鎼併偑閹绢喖纾婚柛鏇ㄥ€嬪ú顏勎у璺猴功閺屽牓姊虹憴鍕姸婵☆偄瀚划鍫ュ醇閵夛妇鍙嗛梺缁樻礀閸婂湱鈧熬鎷�
闂傚倸鍊风粈渚€骞栭位鍥敃閿曗偓閻ょ偓绻濇繝鍌滃闁藉啰鍠栭弻鏇熺箾閸喖澹勫┑鐐叉▕娴滄粓宕橀埀顒勬⒑闂堟稈搴风紒鑼跺亹閼鸿鲸绻濆顓涙嫼闂佸憡鎸昏ぐ鍐╃濠靛洨绠鹃柛娆忣槺婢х數鈧娲樼换鍫ュ极閹剧粯鏅搁柨鐕傛嫹