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 《实用免疫细胞与核酸》 > 第十三章 消化器官免疫细胞化学

第八节 肝脏疾病免疫细胞化学

 

一、乙型肝炎免疫细胞化学

乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(HBV)引起的传染病。乙型肝炎的发病是乙型肝炎病毒与机体之间相互作用的结果。目前研究证明,乙型肝炎病毒并非直接引起肝细胞的损伤,而是由于人体感染乙型肝炎病毒后,引起细胞免疫和体液免疫的应答。因此,人们认为机体免疫应答是引起肝细胞损害的重要原因。乙型肝炎病毒侵入机体后,在肝细胞内进行复制繁殖。乙型肝炎病毒基因组DNA在肝细胞核内进行复制,转录,在合成核心颗粒后,被转运到肝细胞浆内,在通过内质网和细胞膜时合成其外壳部分,并以发芽的形式释放出肝细胞。Dane 颗粒的核心部分含有核心抗原(HBcAg),细胞核内较多,尤其是免疫抑制者更明显。在血清中,HbcAg总是与核心抗体(抗-HBc)形成复合物。故在循环血液中不存在游离的核心颗粒。Dane颗粒的外壳部分含有表面抗原(HBsAg),在释出肝细胞过程中装配上有肝细胞成分。HBcAg 和HBsAg都能引起细胞免疫及体液免疫反应,特别是HBsAg诱发的免疫反应可以引起肝细胞的损害,以细胞免疫反应起主要作用。近年来,对乙型肝炎病毒分子生物学研究证明,HBV基因组有4个可被转录的区域(或4个开放读框),称S,C,P和X区。S区又进一步分为前S1(pre-S1)前S2(pre-S2)和S基因区,主要为组成病毒外壳的三种不同的蛋白编码。前S1和前S2区肽段被认为和病毒对肝细胞的附着有关。目前已明确,HBV有5种抗原表达即HBsAg前S1,前S2,HBcAg(包括HBeAg)和HBxAg。它们在体内均可产生相应的抗体,发生免疫反应。

(一)乙型肝炎的免疫反应发病机理

人体感染乙型肝炎病毒后,可引起细胞免疫及体液免疫应答,并激发自身免疫反应及免疫调节 功能紊乱,致使病变的肝细胞产生或释放大量正常或异常的蛋白质,进一步促使免疫损害加重,使病情不断发展。

1.体液免疫反应在乙型肝炎发病中的作用体内发生HBV感染后,可以产生各种抗原,这些抗原激发机体免疫系统而产生相应的抗体,如抗-HBs,抗-HBc,抗-HBe,抗-HBs1,抗-HBs2和抗-HBx等。这些抗体能对血中的乙型肝炎病毒进行反应加以杀灭。乙型肝炎病毒抗原大多位于胞浆内(HBcAg主要位于核内),部分亦位于胞膜上及核内。因此在抗原抗体发生免疫反应过程中,受病毒感染过的肝细胞亦遭到攻击,使肝细胞受到损害。近来有人报道在肝细胞膜上存在着两种不同的受体:一种受体是能直接和前S1抗原结合,另一种受体是通过多聚人血清白蛋白(PHSA)与前S2抗原结合。前S1或S2抗体出现于HBV感染的早期血清内,具有中和病毒及阻断抗原和肝细胞结合的作用,在抗原抗体发生免疫反应过程中引起肝细胞的损伤。抗原和抗体之间量的不平衡程度决定了乙型青炎病变的程度。当抗原抗体过多时,则出现大量的抗原抗体复合物,可导致暴发型肝炎;当抗原量少,体内产生的抗体可以逐渐清除抗原,则表现为普遍型肝炎;当体内产生的抗体不足以清除抗原时出现抗原过剩,则表现为慢性肝炎;当HBV进入机体后,机体不产生的抗体,无临床症状,则为健康带毒者。目前研究认为,无球蛋白血症的患者(基本上无体液免疫反应),不仅可以发生慢性肝炎,亦可以发生急性肝炎;有些乙型肝炎患者血清中抗原抗体复合物的含量与肝细胞损害的程度不一致,因此,乙型肝炎病毒对肝细胞的损害并非完全通过体液免疫反应。

2.细胞免疫反应在乙型肝炎发病中的作用目前研究认为,细胞免疫反应是乙型肝炎病毒感染后引起肝细胞损害的主要机理。细胞免疫反应是通过杀伤性T细胞(K细胞),自然杀伤细胞(NK细胞)及抗体依赖细胞毒作用而发生。近来研究表明,在细胞免疫反应中,靶细胞抗原包括HBsAg,HBcAg,pre –S1,pre-S2及LSP(肝细胞膜脂蛋白)等。一般来说,急性肝炎靶细胞抗原可能主要为HBcAg,pre-S2,慢性活动性肝炎可能为HBcAg及LSP。近年来研究表明,HBcAg除位于肝细胞核内,也位于胞浆内及胞膜上。HBcAg位于细胞膜表面,可提供为T细胞毒的靶抗原,而且血清中抗-HBc可以和特异性细胞毒性T细胞竞争结合在肝细胞膜上的HBcAg,阻断T细胞的攻击。有人提出,HBcAg的免疫应答对HBV感染有保护作用。有人研究证明,在肝细胞膜上有HBcAg 表达者,细胞毒试验为阳性,且可被抗-HBc封闭,用抗-HBs无效。这表明位于肝细胞膜表面的HBcAg为T细胞的靶抗原。亦有人提出在肝细胞膜上仅有HBsAg,而未发现HBcAg或HbeAg,因此认为HBsAg也是T细胞的靶抗原。在细胞免疫反应中,T细胞要求对靶细胞的特异性抗原和组织相容性抗原(HLA)的双重识别。HBeAg阳性的乙型肝炎患者,肝细胞膜上HLA仅为轻度阳性,而抗-HBe阳性患者则显著增强,提高T细胞清除感染细胞的作用,这可能为干扰素抗病毒的疗效机制之一。在细胞免疫反应中,T细胞除细胞毒效应外,还有淋巴因子效应。致敏的淋巴细胞可以释放各种淋巴因子,如淋巴毒素、细胞毒因子、趋化因子、巨噬细胞移动抑制因子、转移因子等。有人发现淋巴因子可以引起肝细胞广泛坏死,呈小叶中央性或中间带分布。NK细胞在乙型肝炎发病机理中的作用仍不太清楚,亦可能参与细胞免疫反应的调节 作用。由于细胞免疫反应的不同,就出现不同类型的肝炎,表现不同的临床病理特点。如T细胞功能正常,感染病毒量多,毒力强,受感染的肝细胞多而严重,则受到免疫损伤的肝细胞多而且重,表现为急性重型(暴发型)肝炎;如果感染病毒量少,毒力较弱,则发生急性普通型肝炎;如果病毒量很少,毒力很弱,则表现为轻型或亚临床肝炎。如果T细胞呈免疫耐受状态或机体免疫机能缺陷,病毒与宿主共生,病毒在肝细胞内不断复制,感染的肝细胞不发生免疫损,则表现为无症状病毒携带者。如果在T细胞功能不足,免疫反应仅能清除部分病毒及部分肝细胞受到免疫损伤,未被清除的病毒可以反复感染肝细胞并进行复制,于是不断出现肝细胞的损害,表现为慢性肝炎,特别是慢性活动性肝炎。

(二)乙型肝炎与自身免疫反应

正常人由于T细胞对自身抗体系统的调控,在清除老化或破坏的肝细胞时,虽可产生自身抗体,但并不发生自身免疫性疾病。在慢性肝炎,特别是慢性活动性肝炎时,由于T细胞免疫机能缺陷,乙型肝炎抗原(包括HBsAg,HBcAg及HBeAg)与宿主肝细胞表面或内部的蛋白质相互作用,形成含自身组织蛋白的抗原,具有较强的免疫原性,可引起持续的自身免疫反应;也可能由于病毒使机体免疫系统稳定性发生紊乱,细胞免疫失去调控,体液免疫反应亢进,对宿主的自身组织产生抗体,发生自身组织免疫反应,引起肝细胞损伤。有研究表明,慢性活动性肝炎的患者出现对肝细胞表面肝特异性脂蛋白的特异性细胞免疫反应。有人报道,根据肝炎患者肝细胞上免疫球蛋白的沉积,提示存在与HBsAg无关的自身免疫机理。有人认为,肝炎患者病毒性损伤可释放肝特异抗原,使宿主致敏,并使肝损伤持续存在。因此,自身免疫反应在慢性活动性肝炎发病中具有一定的作用。目前已知在慢性活动性肝炎患者常出现某些自身免疫现象,如常伴有关节 炎、皮疹、肾小球肾炎、慢性甲状腺炎及干燥综合症等自身免疫性疾病,患者血清中IgG、IgA及IgM明显升高,血清中可查到抗平滑肌抗体、抗核抗体、抗线粒体抗体、抗肝细胞膜特异性脂蛋白抗体及类风湿因子等自身抗体;有15~30%的患者可查到狼疮细胞。

(三)乙型肝炎肝细胞内病毒抗原的定位及分布

近年来,对乙型肝炎病毒(HBV)分子生物学研究表明,HBV基因组有四个开放读框(Open reading frame, ORF),其中S基因区能编码HBV外壳的结构蛋白,即小S蛋白(主蛋白,HBsAg),中等S蛋白(前S2抗原)和大S蛋白(前S1抗原),它们都具有较高的免疫原性。P区编码具有反转录酶活性的病毒DNA多聚酶。X区编码145至154个氨基酸的多肽,编码蛋白为HBxAg。C区编码HBV的核心部分,即HBcAg 和HBeAg。目前通过免疫组化及免疫电镜等技术均可观察到HBV各种抗原在肝细胞定位及分布状态。

1.HBsAg pre –S1,pre-S2在肝细胞内的分布HBsAg ,前S1和前S2抗原在乙型肝炎,特别是慢性活动性肝炎的肝细胞内检出率为52~65%。HBsAg ,前S1和前S2抗原阳性经常出现于同一部位,甚至同一细胞内。前S1阳性反应比HBsAg和前S2强。有的病例三者并非同时出现,并非在同一位置。少数情况下,HBsAg 阳性,而前S1和前S2阴性,反之,HBsAg 阴性,而前S1和S2阳性;绝大多数情况下前S1和前S2并存在同一部位或同一细胞之内,少数情况下,HBsAg ,前S1阳性而前S2弱阳性或阴性。HBsAg、前S1和前S2抗原主要位于乙肝的肝细胞浆内,部分位于胞膜上,少数位于胞核内。HBsAg ,前S1和前S2抗原阳性物质在肝细胞内的分布大致有三种形态:①包涵体型:阳性物质聚集成团块状,轮廓清楚,呈圆形或卵圆形,位于核的一侧,或者只占据胞浆的小部分,或占据胞浆的大部分,将核推向一侧,此型最为多见;②全胞浆型或弥漫型:阳性物质均匀分布于肝细胞的胞浆内,核往往为阴性位于中央,此型亦较常见;③胞膜型或周边型:阳性物质沿着胞膜或胞膜内侧分布,有人把胞膜型再分为胞膜抗原I型和II型,前者主要表现为S抗原聚集在肝窦侧的肝细胞膜上,呈线条状排列;后者主要累及整个肝细胞膜,呈颗粒状或串珠排列。上述S抗原在肝细胞内分布的三种类型往往是两者或三者联合出现,只是以某一种为主而已,单独存在者少见。S抗原阳性细胞的分布有三种类型:1)散在型,在切片中只见少数散在的阳性细胞,此型多见于慢性迁延性肝炎或静止期肝硬变组织内;2)局灶型,阳性细胞呈簇分布于切片的某一区域,此型多见于急性轻型肝炎或慢性活动性肝炎的组织内;3)弥漫型,多数阳性细胞弥漫分布于切片内,此型多见于慢性活动性肝炎,急性重型肝炎或肝硬变的整个结节 内。不同病例S抗原反应强度及阳性细胞检出率是不同的,就是同一病例不同部位也不尽相同。S抗原阳性物质反应的强弱取决于S抗原的含量。

2.HBcAg 和HBeAg在肝细胞内分布HBcAg多见于乙型肝炎、肝硬变的肝细胞内,特别是肾脏移植病人,有内HBcAg检出率特别高。一般来说,在慢性肝炎HBcAg的检出率在10%~30%不等,其检出率明显低于HBsAg。这可能是由于HBcAg和抗-HBc在核内形成免疫复合物,HBcAg被封闭之故。HBcAg多位于肝细胞的胞核内,少数位于胞浆内及胞膜上。HBcAg阳性物质位于核内常呈细颗粒状均匀分布,少数为斑点状或网状;而在胞浆内则为细颗粒状或絮状;在胞膜上则为均匀细颗粒状。经常出现的是以核型、浆型和膜型同时存在于一个肝细胞内,亦可单独存在。HBcAg阳性肝细胞的分布和HBsAg相似,亦分散在型、局灶型和弥漫型。局灶型经常见于慢性活动性肝炎;弥漫型经常见于肾移植的肝;散在型经常见于急性肝炎或迁延性肝炎。HBeAg阳性物质在肝细胞内的分布状态与HBcAg相似。HBeAg 和HBcAg经常位于同一细胞核内,用罗达明标记双染色证明HBcAg和HBeAg之间有密切关系。HBeAg阳性主要见于HBsAg阳性的慢性活动性肝炎的肝细胞内。

3.HBxAg在肝细胞内分布HBxAg经常见于慢性肝炎的肝细胞内,其检出率为65%左右,比HBcAg和HBsAg高。特别在慢性活动性肝炎检出率更高,约73%;而慢性迁延性肝炎则为43%左右。HBxAg阳性物质为均匀细颗粒状,主要位于肝细胞的胞浆内,少数位于胞核内及胞膜上。不同病例HBxAg阳性物质的分布及阳性反应强度不同,就是同一病例不同部位其结果亦不尽相同。HBxAg阳性肝细胞的分布状态和HBsAg相似,亦呈散在型,局灶型和弥漫型。在慢性活动性肝炎以局灶型多见,其次为弥漫型。有些病例,HBxAg阳性细胞围绕小血管分布,有的则沿着纤维隔分布。HBxAg阳性物质亦见于少数肝内胆管上皮内及kupffer细胞内。

4.IgG(抗-HBc)在肝细胞内分布用免疫荧光及免疫酶技术证实在肝炎组织中存在Igg ,这种IgG 可能就是抗-HBc,该抗体经常和HBcAg以复合物的形式存在于肝细胞核内,少数也见于胞浆内及胞膜上。Rey(1979)还证明这些IgG只见于含有HBcAg 的肝细胞核内。IgG(抗-HBc)阳性物质的分布及其阳性细胞的分布同HBcAg。

 

二、肝硬变免疫细胞化学

肝硬变或称肝硬化(liver cirrhosis)是多种原因引起的慢性肝脏疾病,其中原因之一是和HBV慢性感染有关,特别在中国HBV可能是引起肝硬变的主要原因。HBV感染引起乙型肝炎,部分病例变成慢性活动性肝炎,进而转变成肝硬变。其中大部分为门脉性肝硬变(小结节 型肝硬变),小部分为坏死后性肝硬变(大结节 型肝硬变)。近年来在我国通过临床、病理及免疫病理的研究证明,HBV感染与肝硬变的发生有十分密切关系,在肝硬变内HBsAg检出率为70%~90%。世界其它一些国家和地区,如日本、印度、非州、香港等也有类似的报道。肝硬变的发生可能是由于机体免疫机能不足,不能将HBV完全杀灭和排除。在机体内HBV不断复制繁殖,并通过免疫机制使肝细胞反复遭受破坏,以及肝细胞结节 状再生,纤维组织不断增生,形成纤维隔,致使正常的肝小叶结构破坏,最后形成肝硬变。下面用免疫细胞化学(PAP),亲合免疫细胞化学(ABC)等方法对HBV抗原、纤维结合蛋白(FN)、III型胶原和细胞角蛋白在肝硬变组织内定位及分布进行描述。

(一)肝硬变组织内HBV抗原的定位及分布

用免疫细胞化学(PAP)及免疫亲合素(ABC)方法在肝硬变组织内对HBV抗原(HBsAg ,pre –S1,pre-S2,HBcAgHBxAg)进行了检测,观察了它们在肝细胞,kupffer 细胞内等定位和其分布状态。

1.HBsAg 、pre –S1和pre-S2在肝细胞内分布HBsAg在肝硬变组织中检测率为70%~80%,其中86%伴有肝细胞不典型增生;pre –S1和pre-S2的检出率为60%~70%,其中84%伴有肝细胞不典型增生。HBsAg 、pre –S1和pre-S2抗原经常出现于肝硬变组织的同一部位,甚至同一细胞内。少数情况下,HBsAg阳性,而pre –S1或pre-S2阴性,反之,HBsAg 阴性,而pre –S1或pre-S2阳性。HBsAg 、pre –S1和pre-S2抗原主要位于肝细胞浆内,部分位于膜上,少数位于核内。在部分肝硬变病例中,HBsAg 、pre –S1和pre-S2在也见于kupffer细胞内及肝内胆管上皮细胞内。

2.HBcAg 在肝细胞内的分布HBcAg 在肝硬变组织内的检出率为20%左右,其中82%伴有肝细胞不典型增生。HBcAg 阳性检出率明显低于HBsAg 、pre –S1和pre-S2,这可能是由于HBcAg 和抗-HBc在核内形成免疫复合物,以至HBcAg 被封闭之故。HBcAg 主要位于肝细胞核内的形态表现为分布与肝炎的相似。在少数病例HBcAg 阳性物质也见于汇管区的纤维组织内及肝窦壁上。

3.HBxAg 在肝细胞内的分布HBxAg在硬变组织的检出率为80%左右,其中85%伴有肝细胞不典型增生。HBxAg的检出率和HBsAg相似。HBxAg阳性物质呈细颗粒状。主要位于肝细胞浆内,少数位于胞核内及胞膜上。HBxAg在肝细胞内的形态表现及阳性细胞的分布状态与HBsAg相似。有部分病例HBxAg沿着肝硬变的纤维隔分布。HBxAg阳性物质也见于肝内胆管上皮细胞及kupper细胞内。

4.IgG(抗—HBc )在肝细胞内的分布在肝硬变组织内可观察到抗-HBc的存在,其阳性率与HBcAg相似。该抗体经常和HBcAg以复合物的形式存在于肝细胞核内,少数也见于胞浆内及膜上。抗-HBc阳性物质在肝硬变细胞内的存在和阳性细胞的分布状态与HBcAg相同。

(二)肝硬变组织内纤维结合蛋白(FN)的定位及分布

纤维结合蛋白(fibronectin, FN)是一个非胶原性的大分子糖蛋白。近年来研究发现它与损伤修复及器官硬化有密切关系。在肝硬变及慢活肝的组织内FN沉积增加,可能与肝硬变时纤维组织隔形成有关系。在肝硬变组织内,FN阳性物质位于肝细胞内及kupffer细胞内,其阳率分别为59%、65%。FN阳性物质弥漫分布于胞浆内,阳性细胞多呈三五成群地分布于假小叶边缘、中央静脉旁及肝实质内灶(片)状杯死区域的附近。汇管区及纤维隔内可见数量不等的FN阳性的组织细胞和纤维母细胞。此外。有的病例肝窦壁、血管内皮及小胆管基底膜也呈阳性反应。FN阳性检出率和HBsAg阳性呈正相关,在FN阳性病例中有80%HBsAg阳性。而活动性肝硬变FN阳性明显高于非活动性肝硬变(P<0.01)。上述结果表明,在由HBV感染引起的肝硬变过程中,FN参与了肝硬变的形成。

(三)肝硬变组织内III型胶原的定位及分布

在肝硬变时,I、III型胶原增加,这与肝纤维化有密切关系。实验结果证明,在惭性迁延性肝炎→慢性活动性肝炎→肝硬变之间,Ⅰ、Ⅲ型胶原的分布呈逐渐增加的趋势。除汇管区Ⅰ、Ⅲ型胶原增多外,中央静脉周围及小叶内坏死区、炎症区也增多,形成小叶内纤维化与从汇管伸向小叶内纤维组织相连形成纤维隔。在部分肝硬变病例,肝细胞内有Ⅲ型胶原阳性反应。在纤维隔及假小叶的窦壁上Ⅲ型胶原阳性率为100%,在肝细胞内为34%。Ⅲ型胶原在宽大纤维隔内呈弥漫密集分布,在窦壁上为连续线状分布,在肝细胞浆内呈弥漫分布。阳性肝细胞主要位于小叶边缘或近纤维隔处。动物实验证明Ⅰ、Ⅲ胶原是由肝细胞合成产生的,并参与肝硬变的形成。

(四)肝硬变组织内角蛋白定位及分布

在正常肝脏中肝细胞和胆管上皮细胞各有其特征性的细胞角蛋白(CK)组型,它们是各自形态发生的过程中建立的。研究结果表明在肝硬变组织中有81%呈角蛋白阳性反应,但阳性反应程度各病例是不相同的。CK阳性的肝细胞主要位于汇管区周围。尤其是碎屑状肝细胞坏死附近,并常伴有肝细胞小管状化生、弧立肝细胞团块形成及胆管或胆小管增生,它们之间在细胞形态和阳性强度上有移行关系,有的病例整个假小叶CK阳性。部分肝小多角型细胞也呈阳性反应。在肝硬变组织内CK阳性反应与HBsAg阳性呈正相关。CK阳性的肝硬变中绝大多数HBsAg也阳性,这一结果HBV感染所致的慢性肝脏病变可引起CK的异常表达。

 

三、肝癌免疫细胞化学

原发性肝细胞癌(简称肝癌)是世界上较常见的恶性肿瘤之一,特别在非洲和亚洲一些地区肝癌发病率较高。自从发现乙型肝炎抗原(HBAg)以来,给HBV与肝癌发病关系的研究开辟了新的途径。近年来用免疫细胞化学技术及分子杂交技术对HBV与肝癌发病关系的研究更加深入和广泛,并取得一定成果。全世界各地通过大量的流行病学、免疫病理学、分子遗传学等研究结果表明,HBV感染与肝癌的发病有密切关系,普遍认为HBV是肝癌发病的主要原因。目前尚不完全清楚HBV致癌机理,是具有直接致癌作用或间接致癌作用,这有待进一步研究。

(一)HBV与原发性肝癌的流行病学证据

HBV与原发性肝癌关系的研究已有20余年,目前对HBV作为肝癌病因的证据日益增多,特别是对HBV的分子生物学的研究表明,HBV可能具有直接致癌作用。如下事实可作为临床学和流行病学的证据:

(1)原发性肝癌常发生在HBV流行区,而非流行区则发病率很低。

(2)血清学研究表明:生活在HBV流行区的肝癌病人50%~90%HBsAg阳性,而对照组仅为5%~15%;抗-HBc为80%~90%,而对照组为15%~35%。近年来研究表明,肝癌病人抗-GBx的检出率在85%左右。而对照组很低。些标志物被认为是目前正在发生HBV感染或先前有HBV持续感染的证据。甚至在欧美肝癌发病率很低的国家,肝癌病人HBsAg,抗-HBc和抗-HBx检出率也明显比对照组高。从大量的研究结果表明,在HBV流行区HBV携带者肝癌发病的相对危险性比非携带者高十倍,甚至几百倍。

(3)在HBV流行的人群中,HBV携带者与肝癌家庭聚集性的早期观察,生活早期婴儿从母亲传播感染是HBV慢性携带者,后代亦易成为慢性携带者。Larouze 等发现塞内加尔患肝癌的母亲中71%HBsAg阳性,而相应的对照组仅为13%,在朝鲜和我国台湾省也观察到同样的现象。预防母-婴的HBV传播,对预防肝癌的发生具有重要意义,从研究家族病例来看,大多数最终发生肝癌的个体在出生时或是出生后第一年内从携带HBV的母亲或兄弟姐妹间获得感染。

(4)约80%的肝癌病例发生在肝硬变或慢性活动性肝炎的基础上,而肝硬变和慢性活动性肝炎双往往由HBV慢性持续性感染引起的。在亚洲和非洲一些地区,肝硬变病人90%以上HBsAg阳性,慢性活动性肝炎病人75%以上HBsAg阳性,而对照组只有6%~14%HBsAg阳性。

(二)肝硬变与肝癌的关系

大多数肝癌病合并有肝硬变,部分肝硬变病人可发展为肝癌,这一事实早已被人们所注意。大多数报道肝癌合并肝硬变为80%~90%。肝癌合并肝硬变的类型主要为坏死后大结节 型肝硬变,约占70%~80%,少数为混合型,合并小结节 型肝硬变少见。肝硬变发展为肝癌的百分率,各报道差别较大,但大多数报道为20%左右。坏死后大结节 型肝硬变与乙型肝炎病毒感染有密切关系,HBsAg阳性率很高,达70%~80%。Blumberg等(1977)报道在84例肝硬变中有24例HBsAg阳性,其中6例(25%)发展成肝癌。Obata(1980)指出,HBsAg阳性的肝硬变有23%发生癌变,Nayak(1977)报道,肝硬变发生癌变的机会和其HBsAg阳性有关,HBsAg阳性的肝硬变发生肝癌的机会为51%,而与HBsAg阳性的大结节 型肝硬变有密切关系。大结节 型肝硬变常伴有肝细胞的不典型增生,而伴有不典型增生的肝硬变HBsAg阳性检出率很高,表明肝细胞不典型增生与HBsAg慢性持续感染有密切关系。有人认为不典型增生的肝细胞是一种癌前期病变。

(三)肝细胞肝癌及癌周肝组织内HBV抗原的分布

目前用组织化学、免疫组织化学及免疫电镜等技术可以在人肝癌及癌旁肝细胞内检测到HBsAg、前S1、前S2、HBcAg(HBeAg)及HBxAg等。

1.肝癌及癌周肝组织内HBsAg定位及分布在肝癌组织内,HBsAg阳性率一般来说比较低,大多数报道其阳性率在10%~15%,少数报道阳性率可高达25~44%。肝癌细胞内HB-sAg阳性主要见于分化好的肝癌病例,少数亦见于中度分化及分化差的肝癌病例。一般来说,癌周肝组织内HBsAg阳性率明显高于癌组织。大多数文献报道,癌周肝组织内HBsAg阳性率为60%~80%,少数报道在90%以上。癌周肝组织内HBsAg阳性主要见于癌周肝硬变中,特别是大结节 肝硬变中。这一结果表明,HBV与肝癌的发生有密切关系。肝癌及癌周肝组织内HBsAg阳性的形态和分布状态,不同病例表现不同,就是同一病例不同部位也有很大差异。HBsAg阳性细胞分布亦不规律。绝大多数HBsAg阳性物质位于胞浆内,部分位于胞膜上,少数位于核内。HBsAg阳性物质呈细颗粒状、絮状或网状。HBsAg阳性物质在细胞内分布有三种类型:全胞浆型,阳性物质充满整个胞浆;包涵体型,阳性物质集聚成团,位于核旁一侧;胞周型或核周型,阳性物质沿着泡膜或核膜分布,呈环状。在肝癌及癌周肝组织内包涵体型或全胞浆型较多见。HBsAg阳性细胞的分布有三种类型:弥漫型,多数阳性细胞弥漫分布于切片内;局灶型,少数阳性细胞集聚于某一区域;散在型,阳性细胞较少,孤立的或零散的分布于切片内。一般来说,癌周肝组织HBsAg阳性反应强度和阳性细胞检出率比癌组织高。癌组织检出率低的原因,可能是由于癌组织不适于HBsAg的复制,或是由于HBv DNA和宿主DNA发生整合,而HBsAg不易表达所致。至于HBsAg在肝癌发病中的作用,目前尚不清楚。一般认为HBsAg作为靶抗原,通过免疫反应,造成肝细胞的损伤,肝细胞增生,不典型增生,最终可能导致癌变。

2.肝癌及癌周肝组织内前S抗原的定位及分布对肝癌及癌周肝组织内前S(pre-S1和pre-S2)抗原的研究远不及对HBsAg的研究。近来,国内外文献有少数报道。在肝癌组织内前S1和前S2抗原的检出率为20%左右,略比HBsAg检出率高。在癌周肝组织前S1和前S2抗原的检出率为60%左右,这个和HBsAg的检出率基本相似。在绝大多数HBsAg阳性的病例前S1和前S2抗原亦阳性,而在部分前S1和前S2阳性病例,HBsAg却呈阴性反应。因为在基因构成上,前S1包括前S2和HBsAg,前S2包括HBsAg的部分,故前S1和前S2的表达要比HB-sAg强。用免疫组化方法染色,前S1和前S2阳性物质呈棕红色呈均匀细颗粒状,主要位于癌细胞及肝细胞的胞浆内,有些病例则和/或位于胞膜上及核内。阳性物质反应的强弱和前S1或前S2抗原的含量有关。一般来说,前S1或前S2阳性反应强度和阳性细胞检出率,癌周肝组织比癌组织强。这一规律和HBsAg相同。前S1或前S2阳性物质在细胞内的分布情况及其阳性细胞分布状态和HBsAg的基本相似。目前对前S1或前S2抗原在肝癌发病中的作用尚不完全清楚。有人研究证明,在人肝细胞膜上存在两种不同的受体,一种受体可以直接与前S1蛋白结合;另一种受体通过多聚人血清白蛋白(PHSA)与前S2蛋白结合。所以HBV通过PHSA介质结合在肝细胞上,从而形成靶抗原,通过免疫反应引起肝细胞的损伤,进而可能发生肝细胞的增生,不典型增生,最终导致癌变。

3.肝癌及癌周肝组织内HBcAg(HBeAg)的定位及分布到目前为止,在肝癌细胞内发现有HBcAg只有少数报道。所有的报道,HBcAg的检出率都不太高,大多在10%~20%左右。HBcAg和HBeAg在肝癌及癌周肝组织内不易检出或检出率较低的原因,可能是由于HBcAg 和抗HBc常以免疫复合物的形式存在于胞核内,HBcAg被封闭之故;亦可能由于HBcAg基因和宿主基因进行了整合,使HBcAg不再表达出来。HBcAg和HBeAg经常并存,因此HBeAg亦经常不易单独检出。HBcAg或HBeAg阳性物质呈均匀细颗粒状分布于胞核内,少数见于核仁内。位于核内常呈圆形或卵圆形,围绕核仁占据整个核或占据核的大部分。少数病例HBcAg阳性物质位于胞浆内或胞膜上,有的病例核、膜及浆内同时阳性。HBcAg阳性细胞的分布与HBsAg的分布相似。

关于肝癌的免疫学方面的研究,血清学方面的研究较多,组织学研究的较少。大量的流行病学和临床学方面的资料表明,肝癌患者血清中抗-HBc明显高于对照组,其阳性率高达70%~95%。用免疫组化技术在肝癌及癌旁肝组织内亦发现有抗-HBc的存在。有人证实抗-HBc为IgG,这种IgG经常和HBcAg以复合物的形式存在于细胞核内,少数也见于胞浆及胞膜上。并证实,IgG只见于含有HBcAg的胞核内,而无核内HBcAg,就无抗-HBc存在。因此,如果能测出IgG(抗-HBc),也就间接地证实了HBcAg的存在。IgG(抗-HBc)阳性呈圆形或卵圆形位于核内或以包涵体位于胞浆内。IgG阳性细胞的分布状态和HBcAg的分布相同。IgG(抗-HBc)在肝癌发病中起何作用,目前尚不清楚,有人认为IgG和HBcAg形成免疫复合的,由于免疫反应,在慢性活动性肝炎发病中和肝硬变形成中起重要作用,而慢活肝和肝硬变又是肝癌发生的重要环节 。HBcAg和抗-HBc形成的免疫复合物是否为癌变的始动因素,还有待进一步研究。

4.肝癌及癌周肝组织内HBxAg的定位及分布近年来,对HBV分子生物学研究发现了HBV另一种抗原,即HBxAg。HBxAg和肝癌发生的关系密切,已引起人们广泛的重视。目前,国内外已有少数文献报道关于HBxAg和肝癌发病的关系的研究。在人原发性肝癌组织内HBxAg的检出率大约为60%~80%,这明显高于HBsAg的检出率。在癌周肝组织内HBxAg阳性检出率在70%~80%,这和HBsAg的检出率基本相似。用PAP或ABC方法检测HBxAg,其阳性物质呈棕褐色均匀细颗粒状,主要位于癌细胞和肝细胞胞浆内,部分病例除胞浆阳性外,胞膜或核亦阳性(约20%),单独膜型或核型少见。不同病例HBxAg阳性物质的分布及阳性反应强度是不同的,就是同一病例不同部位,其结果也不尽相同。一般来说,癌周肝组织内HBxAg阳性检出率及阳性反应强度比癌组织内高。其反应强弱与HBxAg含量多少有关。HBxAg阳性细胞分布与HBsAg阳性细胞分布相似,亦分为散在型,局灶型和弥漫型。在癌周硬变组织内,HBxAg阳性细胞有时围绕小血管分布。有的则沿着纤维膈分布。在HBxAg阳性病例,有24%在癌组织内伴有HBsAg和/或HBcAg,有72%在癌周肝组织内伴有HBsAg和/或HBcAg。HBx-Ag在肝癌发病中的作用,目前尚不完全清楚。有人报道在肝癌患者血清中含有较高的抗-HBx,其检出率高达85%。Miyaki等(1986)发现在所检查的原发性肝细胞癌组织中都存在和HBV的X基因相同的DNA序列。有些作者认为,宿主细胞DNA和HBv DNA的整合是通过X基因区特殊的重组来完成的,其翻译产物-HBx蛋白(HBxAg)对癌基因具有反式激活作用,而引起细胞癌变。最近有人通过HBV的X基因在转基因小鼠中诱发肝癌的动物实验证明,HBx蛋白能够改变宿主基因的表达,并导致肝细胞癌的发生。因此,有些作者认为HBxAg在肝癌发生中具有重要作用,并认为HBV可能具有直接致癌作用。

(四)肝内胆管细胞癌及癌周肝组织内HBV抗原的分布

在原发性肝癌中,最常见的是肝细胞肝癌,而肝内胆管细胞癌比较少见,在我国大约为10%。长期以来,人们对肝内胆管细胞癌的病因及发病机理研究甚少,认识不清。早年候宝璋曾报道,胆内提管细胞癌的发生与中华分枝睾吸虫感染有关。最近有文献报道,在肝内胆管细胞癌及其癌周肝组织内检测出HBv 5中抗原(HBsAg、pre-S1、pre-S2、HBxAg和HBcAg),而且检出的阳性率很高。王文亮等报道(1993),在20例肝内胆管细胞癌中,HBxAg阳性检出率为75%,pre-S1和S2各为40%,HBsAg为10%;在19例癌周肝组织中,HBxAg阳性检出率为84%,pre-S1和S2各为47%,HBsAg t HbcAg分别为32%。在20例肝内胆管细胞癌的病例中有17例(85%)有不同HBV抗原的表达,其中HBxAg阳性检出率为80%。这一结果表明,肝内胆管细胞癌的发生与HBV感染有密切关系。HBV5种抗原在肝内胆管细胞癌及其癌周肝组织内的阳性反应及阳性细胞分布状态与肝细胞肝癌相同。肝内胆管细胞癌的发病过程可能与肝细胞肝癌不完全相同。肝细胞肝癌80%伴有肝硬变,特别是大结节 型肝硬变。一般认为大多数肝细胞肝癌是由于HBV感染→慢性肝炎→肝硬变→肝癌。而肝内胆管细胞癌很少伴有肝硬变,它的发生过程主要不是通过肝硬变这一重要环节 ,而是由慢性肝炎,肝细胞不典型增生或中间型细胞演变为肝癌。HBV是否有直接致癌的作用尚有等进一步研究。

(五)肝细胞癌中的HBV的分子生物学

近10年来,国内外对原发性肝细胞癌中乙型肝炎病毒DNA的存在,分布及意义进行了广泛的研究,并取得了可喜的成果。用southern blot 分子杂交技术及原位分子杂交技术,在肝癌患者血清中和肝癌组织中检测HBV-DNA的分布状态。用HBV-DHA基因或其亚基因标记同位素(32P、35S等)及生物素地高辛等作为探针和肝癌及癌旁肝组织中的DNA进行杂交,通过放射自显影法检测HBV-DNA存在状态(是整合或游离);原位分子杂交经过染色反应观察细胞内HBV-DNA的定位和分布状态。有人用southern blot方法检测肝癌病人血清中HBV-DNA的情况,只有少数病例血清中有微量的HBV-DNA,则慢性乙型肝炎患者血清却多为阳性,提示在HBsAg阳性肝癌病人血清中很少或没有可测出的HBV-DNA。目前,国内外已有不少文献报道,在肝癌组织中有整合的HBV-DNA。例如,Shafritz等(1981)检测了20例来自南非的肝癌患者,有15例HBV-DNA整合人宿主细胞DNA中,其中12例HBsAg阳性,3例HBsAg阴性而抗-HBs阳性。Tiollais(1981)检查了15例来自欧洲的肝癌标本,HBsAg或抗-HBs阳性病例,检查结果HBV-DNA均以整合形式存在。他们还观察了32例HBsAg阳性的肝癌病人,结果证明在所有肝癌组织中均有HBV-DNA。国内大多数报道在肝癌组织中HBV-DNA检出率为60%~80%。上述结果表明,人原发性肝细胞癌的发生和HBV感染有极为密切关系。

(六)肝癌发生中HBV分子遗传学及免疫机理

免疫病理学及分子生物学的研究表明,HBV不仅有间接致肝癌作用,而且还可能有直接致癌作用。HBV致癌作用的分子机理目前集中对于HBV的分子遗传学和分子免疫学的研究。在原发性肝细胞癌发生中,HBV致癌作用可能有两个模式:一是病毒的癌基因模式,就是表达病毒的癌基因(HBV-DNA);另一个是细胞癌基因模式,在肝细胞癌变过程中,细胞癌基因可能发生启动子插入,染色体异常(缺失、重复、易位)及点突变等。研究证明,机体感染HBV后,HBV将其本身的基因掺入到肝细胞核内,和宿主细胞基因发生整合,从而使正常的肝细胞转变为癌细胞。这需要经过一个复杂的演变过程。在肝癌的HBV-DNA整合部位,常发生染色体缺失、重复或易位。Slagle等(1990)研究发现,有44%的肝细胞癌病人发生染色体的丢失,而17P的丢失常包括抑癌基因P53的丢失,这可能是肝细胞癌发生的原因。Blum(1985)认为在HBV-DNA整合位点附近宿主细胞基因有重排现象。Tiollais等认为病毒DNA整合人宿主细胞DNA或与DNA发生重排,产生HBV激活的基因或激活细胞的原癌基因,进而导致细胞的转化,最终发生肝癌。有人通过实验研究证明病毒插入到细胞原癌基因附近,作为一种诱变剂,可能直接参与肝细胞癌的发生。Seifter等(1990)在体外进行X基因的转化实验,将HBV-DNA或X基因序列连在SV40早期启动子的加强子上,用以转化传代鼠肝细胞及传代鼠纤维母细胞,转染成功的能稳定复制HBV的肝细胞表现出恶性生长的特征,将其接种裸鼠,显示出致癌性,并激活细胞原癌基因c-fos过量表达。这提示,HBV-DNA含有致癌基因序列,可以促进细胞向恶性转化。HBV基因组中编码加强子和X蛋白的碱基序列也有某些致癌活性。尽管如此,到目前为止,HBV致癌的分子机理尚不完全清楚,有待进一步研究。

(王文亮)

 

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