第三节 临床生化方法学的评价
一、评价实验与分析误差类型的关系
方法学评价（evalution of methodology）的基本内容是通过实验途径，测定并评价方法的精密度与准确度，在实验中测定的是不精密度与不准确度，不伦精密度还是准确度，强调的都是误差，评价实验的过程就是对误差的测定。因此，方法评价的各项实验是配合检测各种类型的分析误差而设计的，表20-1表示了它们之间的关系。
表20-1 评价实验与分析误差类型的关系
| 分析误差的类型 | 评价实验 | |
| 初步试验 | 最后试验 | |
| 偶然误差 | 批内（或天内）重复性 | 天间重复性 |
| 恒定误差 | 干扰 | 与比较方法对比 |
| 比例误差 | 回收 | |
二、实验方法的评价
（一）重复性试验
目的在于考察候选方法的随机误差，重复性试验的方法是对同一材料分成数份试验样品，进行多次分析测定。
⒈试验形式与方法 ①批内重复性试验：可以用同一份标本在相当短的时间内，按规定的操作方法，在较稳定的条件下，作多次（一般为20次）重复性测定。计算其X、S与CV。不同性质的分析对CV值的要求不同，一般应小于5％，精密的分析或多次平行测定，要求小于2％。②天内重复性试验：在一天内对一个或数个标本作数批重复测定，其它条件和批内相同，但因在一天内重复测定几批，所受影响因素要比批内多，所得的CV值可能比批内大一些。③天间重复性试验：将同一标本每天一次随机插入常规标本中测定，连续20个工作日，这样得到的CV值比上述批内与天内大，能反映实际工作的情况。④病人标本的平行双份测定：如不易得到含有合适基质的稳定样品（如作血液pH的重复性测定的标本），可采用病人标本的双份测定来代替重复性试验，选择一批病人标本（20至100份），待测物浓度应在实验方法的分析范围内，有高有低；记录标本的特性，如有某种药物、混浊、溶血或有尿毒症等，可影响其准确性。可作一批或几批分析，但每一标本都平行做两份，用双份分析结果之差（d）来计算S（∑d/2N）作为不精密度的指标。
⒉分析样品的选择作重复性试验的样品，应用标准液、控制物溶液、病人标本或混合血清均可，视其用途而定。作批内重复性试验，用标准液可以得到各种不同浓度，较简便，它代表了最好的重复性性能。若结果良好，说明方法操作是适宜的，再进一步用其它样品进行测定。在进行天间重复性试验时，用冻干质控血清较好，因其稳定、方便。其它样品进行测定。在进行天间重复性试验时，用冻干质控血清较好，因其稳定、方便。
⒊分析物浓度的选择进行重复性试验时被测物浓度，宜选择在医学上具有决定性意义的浓度进行试验，因为这种浓度在临床分析实验结果时最有用处。
（二）回收试验
所谓回收即分析方法正确测定加入常规分析样品中的纯分析物的能力。目的是测定比例系统误差，以衡量候选方法的准确度。
⒈方法将被分析的纯品标准液加入病人样品中，成为分析样品，原病人样品加入相同量的无分析物的溶液作基础样品，然后用实验方法分析，两者测定结果的差值为回收量。
⒉回收率计算 以测定血清钙为例说明如下：
⑴样品制备
1)基础样品：血清2ml＋蒸馏水0.1ml；
2)分析样品：血清2ml＋4mmol/L钙标准液0.1ml；
3)分析样品：血清2ml＋25mmol/L钙标准液0.1ml；
⑵计算公式及计算结果
故本例的②③管的加入量分别为：
回收浓度＝分析样品测得浓度－基础样品测得浓度
回收率（％）＝回收浓度/加入浓度×100％
本例结果见表20-2
表20-2 血清钙回收试验结果
| 测得浓度（mmol/L） | 加入浓度（mmol/L） | 回收浓度（mmol/L） | 回收率％ |
| ①1.70 | ― | ― | ― |
| ②1.88 | 0.19 | 0.18 | 94.7 |
| ③2.85 | 1.19 | 1.15 | 96.6 |
| 平均 | 95.7 |
理想的结果期望回收率达到100％，现在平均回收率为95.7％，有4.3％的比例误差，它表明一个含钙真值为2.5mmol/L的标本，若用该方法测定，约为2.39mmol/L（2.5×95.79％），误差为0.11mmol/L（2.5×4.3％）。
⒊注意事项
①准确吸量，因为被分析物的理论值是根据加入标准液体积及原样品的体积计算所得，吸量稍有不准，就会影响结果。因此，选择经过校准的吸管，严格地清洗与干燥，以及按正规要求吸量均很重要。②样品中加入标准液后，总的浓度必须在测定方法的分析范围内，一般须作加入高、中、低不同浓度的回收试验，计算平均回收率。③加入标准液后，最好使实验样品中被测浓度达到医学上具有决定意义的浓度。④加入标准液的体积在整个样品中要少，一般在10％以内。若稀释过大，误差将发生改变，甚至消失。
（三）干扰试验
干扰试验的目的也是用来衡量候选方法的准确度的。在加入一定浓度的干扰物的条件下，形成的是恒定系统误差。干扰物浓度不同，误差大小也不同。
⒈方法基本与回收试验一样，但是加入的是疑有干扰或非特异性反应的物质而不是标准液。以肌酐对葡萄糖测定的干扰试验方法及结果简述如下：
样品制备
1)基础样品：0.9ml血清＋0.1ml蒸馏水。
2)分析样品：0.9ml血清＋0.1ml 442μmol/L肌酐溶液。
3) 分析样品：0.9ml血清＋0.1ml 884μmol/L肌酐溶液。
所有各样品均作双份葡萄糖测定取平均值。加入值的计算同回收试验。分析样品与基础样品两值之差为干扰值。结果如下：
| 葡萄糖测得值 | 加入肌酐值 | 干扰值 |
| 5.55mmol/L | － | － |
| 5.77mmol/L | 442μmol/L | 0.22mmol/L |
| 6.16mmol/L | 884μmol/L | 0.61mmol/L |
结果说明：每88.4μmol/L肌酐约使葡萄糖测定增加0.056mmol/L。在正常人，肌酐约为132μmol/L，将使葡萄糖测定带入约0.11mmol/L的误差，在临床上并无意义。但肌酐病理值可达884-1786μmol/L，对葡萄糖测定引入约0.56-1.11mmol/L误差，就会影响临床应用。
⒉可疑干扰物的浓度加入可疑干扰物的浓度须达到有价值的范围，有可能应达到病理标本的最高浓度值，在确证有影响后应测定在何浓度时，产生的误差在临床上无意义，即确定使分析结果影响临床应用价值的最低可疑物浓度值。
⒊被试验的物质可根据该方法的反应原理，提示出可能的干扰物。一般应考虑的是用胆红素、溶血（血红蛋白）、脂血、防腐剂、抗凝剂等进行试验。但干扰试验有一定的局限性，因为人们只能试验某些物质的影响，还有许多药物和食物成分未经试验，亦不能认为无关。干扰试验也可用比较方法进行，比较方法若为常规方法更应如此，若两个方法具有相同干扰，这种干扰不应作为否定试验方法的理由，试验方法应在其它性能方面较原常规方法为好，从而对检验质量有所提高。
⒋消除干扰的常用方法 ①作空白（对照）试验。一是试剂空白，可以校正标本读数中的试剂部分；另一种是标本空白，用以补偿标本中被测物以外的其它物质的影响。②采用各种物理、化学的方法、分离除去干扰物。③近年来出现的由计算机控制的双波长或多波长检测仪器，在排除干扰因素方面既有效又简便（详见仪器分析有关内容）。
（四）方法比较实验
对比试验用于检测候选方法的系统分析误差，包括比例和恒定两种系统误差在内。如果对适当的数据进行分析，也可提供系统误差的性质究竟是属恒定误差还是比例误差。
⒈方法对一组病人的标本用候选方法和对比方法同时进行分析测定，最后观察两者之间的差异。这是考验候选方法是否可被采用的重要措施。
⒉比较方法的选择在临床生化常规方法评价时，最好选择参考方法作为对比方法。这样在解释结果时，就可把方法间的任何分析误差都可归于候选方法。
⒊注意事项 ①试验样品数：一般作40-100例，包括各种疾病的样品，即包括在常规工作中可能遇到的整个分析范围。选择合适的样品比增加试验样品的数目更为重要。②重复分析：一般每个样品用两种方法各测定一次，最好各测定两次，不是平行测定，而是分两批进行。两种方法及两批测定，须在同一天内，最好是在4小时内进行。③时间间隔：每天测定2-5个样品，约测定20天。④结果的图示：根据实验结果作坐标图，比较方法所得数值为横坐标，候选方法所得数值为纵坐标，用以定性地估计分析误差。进行双份测定时，候选方法的第一次结果与对比方法的第一次结果作图；第二次结果也如此。溶血、脂血、黄疸标本，可在相应的散点上标以H、L、I等符号。每天测定的结果应及时绘于图上，以便及时检查结果，发现问题，对结果有矛盾的样品，可取原样重新测定。
⒋统计处理方法比较试验所得的结果是配对资料，可进行配对资料的统计处理，包括配对t检验、相关和回归分析等。通常都选用相关回归分析方法，因为此法可以计算出所研究浓度范围内任一浓度的系统误差。从回归方程y＝a＋bx中，可显示出候选方法有无系统性误差。这种误差分三类：恒定系统误差与比例系统误差，或两者兼有。回归线的截距a代表恒定误差，回归系数（回归线的斜率）b代表比例误差，相关系数r代表两种方法的相关性是否密切。
实际情况并不简单，X与Y值都有偶然误差存在，b与a只是估计值，需要确定其可信限。在评价一种候选方法时，如果a＝0，b的数值稍偏离1.0，那么这种偏离程度是否小到可以忽略不计，因而使候选方法可以接受。这就需要参考a及b值的变动范围，根据经验判断是否可以适用于临床检验的目的。在方法比较试验中的相关系数r可作为候选方法可否接受的一种指针，但r值随病人标本测定范围的增加而增大，因此，在配对资料分析中，不应片面地根据相关系数r来判断两种方法分析结果的符合程度。