首页\中医书籍\西医备考\《动脉粥样硬化》\
 《动脉粥样硬化》 > 第二十章 低密度脂蛋白受体的检测

第五节 LDL-R基因突变的常用研究方法

一、Southern印迹法

Southern印迹法在鉴定LDL-R基因缺失突变中得到了广泛的应用。采用多种限制性内切酶切,以LDL-R基因片段和外显子特异性片段作探针,进行杂交,再放射自显影,对FH进行限制性酶切图谱分析,可检测FH患者的不同外显子区域不同长度的部分缺失类型。

二、PCR法和核苷酸序列分析法

采用PCR法将包括点突变的受体基因片段扩增,再经核苷酸序列分析即可发现点突变位点。影响酶切位点的点突变可经PCR扩增、特定的限制性酶切、电泳,检测出异常片段。

三、寡核苷酸探针法

本法采用的是一对寡核苷酸探针,其中一个与正常基因顺序互补,另一个与突变序列互补,因此需用到多种特异的寡核苷酸探针,是鉴定点突变的一种快速而简便的方法,当一个或二个点突变在某一特定人群中成为突变的主要原因时,就可建立这种方法对某一地区的某一主要突变进行筛查。

四、RFLP连锁分析法

限制性片段长度多态性(restriction fragment lengthpolymorphism,RFLP)是采用不同的限制性核酸内切酶酶切和多种cDNA片段探针,根据DNA多态性片段的出现,确定LDL-R基因的连锁相。

本法需进行家系分析,多态位点必须有一个以上是杂合的,并且要排除细胞减数分裂时基因重组对多态位点的影响。

五、长链PCR法

常规的PCR扩增长度不超过3kb,不适合检测大片段的受体基因缺失突变,Southern印迹法亦繁琐复杂,近年来长链PCR技术的研究为检测LDL-R开辟了新途径。下面详细介绍由周天鸿等建立的长链PCR法在检测LDL-R基因大片段缺失突型中的应用。

引物:设计5对寡核苷酸引物,见表20-6。

表20-6 PCR扩增引物序列

PCR引物核苷酸序列
PA15’CAACACACTCTGTCCTGTTTTCCAG3’
PA25’GCCCTTGGTATCCGCAACAGAGACA3’
PB15’AGTCTGCATCCCTGGCCCTGCGCAG3’
PB25’AGGGCTCAGTCCACCGGGGAATCAC3’
PC15’CCAAGCCTCTTTCTCTCTCTTCGAC3’
PC25’CCACCCTCCGCCTTCCCGTGCTCAG3’
PD15’TCCATCGACGGGTCCCCTCTGACCC3’
PD25’AGCCCTCATCTCACCTGCGGGCCAA3’
PE15’AGATGAGGGCTCCTGGTGCGATGCC3’
PE25’GCCCTTGGTATCCGCAACAGAGACA3’

DNA:由健康人和FH患者外周血制备DNA。

长链DNA扩增:采用引物PA1和PA2扩增LDL-R基因中外显子5~10的片段。

PCR扩增制备探针:采用引物PB1/PB2、PC1/PC2、PD1/PD2、PE1/PE2制备LDL-R基因外显子7、8、9、10的同位素探针。

PA1对应于LDL-R基因外显子5的5'端侧翼序列,PA2对应于外显子10的部分序列,此对引物扩增产物为含外显5~10的基因片段。正常人得到1条7kbDNA片段,FH患者得到2条DNA片段,一条7kb,一条4.4kb,表明FH患者是杂合子,其一个LDL-R等位基因正常,另一个等位基因外显子5~10之间存在着一个2.6kb的缺失,见图20-4。将产物用EcoR1酶切,得到的产物电泳图谱见图20-5。最后用PB、PC、PD、PE4对引物,以正常基因的长链PCR产物为模板,用PCR法获得外显子7、8、9、10的探针,将这些探针分别与正常基因的突变基因的长链PCR产物杂交,其结果见表20-7。

采用长链PCR技术可快速、简单、准确地检测大片段的缺失突变,可应用于临床基因诊断,尤其是有遗传背景的FH高危人群的基因筛查。

FH患者LDL-R基因缺失示意图

图20-4 FH患者LDL-R基因缺失示意图

长链PCR产物电泳示意图

图20-5 长链PCR产物电泳示意图

a:FH患者基因PCR扩增产物;b:健康人基因PCR扩增产物;c:CNA分子量标记。

表20-7 LDL-R突变基因和正常基因长链PCR产物与外显子7~10探针的杂交结果

长链PCR产物探针外显子7探针外显子8探针外显子9探针外显子10
突变基因--++
正常基因++++

(刘芳)

 

缂傚倷鐒﹀褰掓偡閵夆晛鑸归柟缁㈠枟閸庡酣鏌熺紒銏犳灀闁稿鎸搁~婵嬫惞椤愩倗娉�

濠碘槅鍋撶徊楣冩偋閻樿违闁跨噦鎷�闂備胶枪椤戝懐鎹㈤幋锕€钃熼柨鐕傛嫹闂備胶枪缁绘鐣烽悽绋挎瀬闁跨噦鎷�闂備礁鎼崐濠氬箠閹惧瓨娅犻柨鐕傛嫹濠电偞鍨跺Λ鎴炰繆閸ヮ剚鍎撻柨鐕傛嫹濠电偞鍨堕幖鈺呭矗閳ь剛鈧鎼幏锟�缂傚倷绀侀ˇ鎷屾懌闂佸搫鐭夐幏锟�闂備浇鍋愰悺鏃堝垂閺夋5褰掓晸閿燂拷闂備焦鐪归崐鏍€冮崱娆愬厹闁跨噦鎷�闂備浇鍋愰悺鏃堝垂闁秴钃熼柨鐕傛嫹闂備礁鎼崐鍝ョ礊婵犲倵鏋栭柨鐕傛嫹闂佽崵鍠愰悷銉ノ涘┑瀣ㄢ偓鍌炴晸閿燂拷缂傚倷绀侀惉鑲╂崲濠靛牏绀婇柨鐕傛嫹闂備礁鎲¢崝鏇㈠箠閹板府缍栭柨鐕傛嫹濠电姰鍨奸崺鏍偋濠婂牞缍栭柨鐕傛嫹濠电姷顣介埀顒冩珪瀹告繃銇勯顒佸闂備焦鐪归崹浠嬎夐幘浼欑稏闁跨噦鎷�闂備礁鎲¢悷杈╃礊閳ь剟鏌涘鍫熷闂備礁鎽滄慨鎾囬柆宥忕稏闁跨噦鎷� 濠殿喗宕块崱妤€鎯為梺绋库康閹凤拷闂備焦妞挎禍锝夊磻閹板府缍栭柨鐕傛嫹闂備礁鍚嬪妯煎椤擃澁缍栭柨鐕傛嫹闂備胶枪濮橈箑鈻旈弴顫稏闁跨噦鎷�闂備浇澹堢亸娆愭叏妤e啫纾块柨鐕傛嫹婵犵數鍋涢ˇ顖炴嚐椤栨粎绀勯柨鐕傛嫹闂備胶鍘у鍓佹崲閸℃稑纾块柨鐕傛嫹闂備胶鍘у鍓佺矙閺嶎厼纾婚柨鐕傛嫹濠德板€楁慨浼村礉鎼搭煉缍栭柨鐕傛嫹缂傚倷妞掗懗鍫曞磻閻斿搫鍨濋柨鐕傛嫹闂備礁鎲$粙鎾诲储瑜旈獮鍡涙晸閿燂拷闂備焦妞块悡鍫ュ窗濞戙垹纾婚柨鐕傛嫹闂備浇澹堢亸顏勨枖閺囩倣锝夋晸閿燂拷缂傚倸鍊稿ú銈嗩殽閹间緡鏁婇柨鐕傛嫹濠电儑绲藉ú锔炬崲閸屾稓顩烽柨鐕傛嫹闁诲海鍋i崐娑樷枖濞戙埄鏁嬮柨鐕傛嫹闂傚⿴鍋勫ú銈夊疮閹惰棄绀堥柨鐕傛嫹
闂佸搫顦弲婊堝蓟閵娿儍娲冀閵婏絼绨婚梺鍓插亝濞叉牠宕濋敓锟�