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 《中国幽门螺杆菌研究》 > 1.幽门螺杆菌的分子生物学研究

幽门螺杆菌与胃粘膜上皮超威结构的关系

自1983年澳大利亚的Warran和Matshall从慢性活动性胃炎病人胃粘膜活检标本中找到幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)后,先后已有英国、荷兰、德国、美国、加拿大、日本、秘鲁及我国从慢性胃炎和消化性溃疡等病人中分离到此菌。这此些报道普遍反映了胃粘膜中Hp检出与慢性胃炎、消化性溃疡的存在两者之间有高度的相关性。Matshall(1985)和Morris(1987)先后还用Hp作自身感染实验,均证明能引起急慢性胃炎,Morris并观察到能发展成慢性胃炎,这进一步证实了Hp对人类胃粘膜致病的可能性。但Hp如何致病?Hp是否属于弯曲菌属?目前仍存在着争议。为此,本文用透射和扫描电镜对Hp形态结构及其与胃粘膜上皮的关系进行了观察,旨在为阐明Hp的生物学地位及致病性提供某些线索。

1 材料和方法

1.1 活检标本及菌种

33例活检标本采自经内窥镜诊断为浅表性或萎缩性胃炎患者近幽门部位的胃粘膜。Hp菌种31株,从慢性胃炎或消化性溃疡患者胃粘膜活检中分离而得。空肠弯曲菌(Campylobacterjejuni,CJ)菌株:CJ(CF-1)由上海市卫生防疫站提供:CJ(82-56)由苏州医学院生物学教研室提供。胎儿弯曲菌(Campylobacter fetus,CF)及结肠弯曲菌(Campylobactercoli,CC)菌种各两株,其中CF(GIFu 8735)及CC(GIFU 8733)由日本大阪大学三轮各俊夫教授提供,另有CF及CC各一株由法国巴黎第五大学Berche教授提供。

1.2 电镜检查

1.2.1 透射电镜标本制备活检标本在含2.0%戊二醛的二甲砷酸钠缓冲液(pH7.3)中固定2h~4h,二甲砷酸钠缓冲液洗2次后在1%四氧化锇中作后固定、包埋、超薄切片。菌株超切片标本取自血平板上培养2d~3d的菌落。无菌生理盐水轻轻洗下,3000r/min20min离心沉淀,弃上清,以无菌生理盐水重复洗涤一次后,取沉淀作透射电镜标本制备,方法同上。

细菌悬滴标本制备:于清洁蜡块上滴一滴新鲜培养的细菌悬液,以喷涂炭膜的铜网覆盖其上,静止15min,取下铜网,用滤纸吸去残剩液体。再覆盖在一滴20%的磷钨酸上负染15min,取下铜网,吸去残剩液体,自然干燥后待检。上述各标本在日立-500电镜下观察。

1.2.2 扫描电镜标本制备活检标本(用生理盐水洗去表面杂菌及粘液)在戊二醛二甲砷酸钠固定液中固定2h~3h,经二甲砷酸钠缓冲液洗2次后,直接在乙醇中作梯度脱水,然后移入100%醋酸异戊酯,在临界点下干燥,真空涂金。菌落标本制备:取经2d~3d培养的Hp血平板,选择菌落生长良好区域,节下约1cm2琼脂块,轻轻浸入上述电镜标本固定注中固定。随后制备步骤同上。上述标本均在JEOlJSM-840扫描电镜下观察。

2 结果

2.1 Hp的形态结构从不同病人胃粘膜上分离得Hp的形态结构基本一致,呈“S”形弯曲、弧形或稍直,偶见分支状。一般表面较光滑,末端或二端(多数为一端)具有2~6条鞭毛,长度稍长于菌体。鞭毛外均有明显的鞘,带鞘的鞭毛直径约50nm的圆球状结构相连。菌体末端鞭毛基础结构内侧,有一宽达200nm~400nm的电子密度明显降低区域,其底部无明显的细胞膜结构为界。在光滑的菌体表面有进呈现大小较均匀、排列整齐的突起。在参考菌株中,CJ与CC末端呈圆锥体样,稍尖,顶端明显地呈吸盘样结构。GF亦见较小的吸盘样凹陷。CF,CC,CF均有单根无鞘端鞭毛从顶端的吸盘样凹陷中伸出。根部均未见圆球体状基础,CJ与CC均未见电子密度明显降低区域。

2.2 Hp与胃粘膜上皮的关系活检标本包括胃粘膜及其表面的粘液两部分。一般情况下,胃粘膜上皮与粘液层间不存在细菌。若出现细菌,常为大小、形态都呈弯曲样特征的菌群。多聚居在胃小凹的细胞与细胞间连接处部位。偶然尚可见Hp存在于壁细胞的分泌小管中。Hp与粘膜上皮细胞间保持一定的间距,借众多的细丝状网状结构使两者互相粘附。另一种是细菌的部分细胞壁与上皮细胞的细膜膜直接相贴粘附,二者间几无间距。以前者较为多见,有时在同一细菌可出现两种粘附现象。在粘膜上皮表面有Hp粘附的区域附近,往往有炎性细胞的浸润和渗出。Hp粘附处的上皮细胞除微绒毛明显减少或消失外,很少发现有明显的细胞病理学变化。胃粘膜上皮细胞中偶见对Hp吞噬现象。粘膜上厂表面的粘液层分不溶性粘液与可溶性粘液两部分。正常情况下不溶性粘液层为包裹在粘膜上皮表面的连续层,可溶性粘液为其周围的流动滋润层。在超薄切片下,出现Hp的标本中,Hp在不溶性粘液层中大致呈散在的分布状态,且大多呈同方向排列。不溶性粘液中的Hp主要呈横断面,而在其外侧的可溶性粘液层中则随意排列,还可见到纵断面、横断面甚至斜断面等不同的切面。经用无菌生理盐水充分冲洗的活检标本,在扫描电镜下可见Hp不规则地粘附在不溶性粘液层表面。

3 讨论

目前弯曲菌属的分类,主要根据光镜下的形态特征、培养特性、生化反应及其DNA的G加C百分比含量等。这些性质与螺菌族中其他细菌有很多交叉,以致造成对Hp归属的意见不一。我们用透射电镜和扫描电镜进行了形态结构的观察,并参考有关文献,发现Hp与CJ,CC,CF在鞭毛源出部位,数量及结构等方面存在着明显的不同。例如,Hp与CJ,CC,CF均有端鞭毛。我们从Hp中看到每一根鞭毛有一只镶嵌在细胞膜和细胞壁中的,圆球体为基础,其内侧尚有一明显的电子密度降低区。而其他弯曲菌属细菌却未找到此结构,仅CF亦见有电子密度降低区。由此可见Hp鞭毛及共结构的特征与弯曲菌属其他细菌有所不同。而Hp的末端钝圆等与水螺菌中的一个种(Aquaspirillum serpens,AS)却相似,因此有人认为它很可能属水螺菌属。Hp与弯曲菌属其他细菌间的区别除了鞭毛及其有关结构外,Hp能分解尿素,而其他主要的弯曲菌属细菌均不分解尿素,亦是一重要特征。另外还在分类学上有重要意义的菌体脂肪酸组成、16rRNAHp的部分核苷酸顺序分析、菌体蛋白质电泳图谱方面Hp与弯曲菌属的主要代表菌种之间都有明显差别。因此Hp是否应属弯曲菌,还值得商榷。

Hp致病机理,虽然有 Marshall和Morris等作了自身感染实验,但它的具体致病机理仍然缺少解释。从我们在电镜下观察,Hp进入机体后侵入的途径很可能是:Hp首先粘附在不溶性粘液层表面,然后藉其螺旋状菌体特征及特殊的鞭毛运动方式迅速钻入不溶性粘液层中间,继而与粘膜上皮细胞接触,并大多在胃小凹及粘膜上皮细胞连接处粘附定居。胃中寄生菌虽然不多,但过路菌是很杂的,且胃酸比较强,粘膜表面有不溶性粘液层作屏障,胃粘膜上皮及其分泌的粘液代谢又很快,为什么仅有Hp能在胃粘膜上寄生?这一方面可能由于Hp螺旋状的菌体特征和它鞭毛的特殊运动方式,促使它比一般肠道杆菌更容易穿透不溶性粘液层。由于不溶性粘液的分子结构呈索条状,当Hp钻入其间时,易呈相对平行状态,这与光镜下所见Hp在粘液中呈鱼贯状分布相符。另一方面可能由于Hp对粘膜上皮细胞有特殊的亲和结构。正如我们所观察到的那两种粘附现象,它们很可能在这中间起着重要的决定作用。这种特异性粘附现象从胃的肠化生组织找不到Hp,在肠的胃脂有利于组织却能找到,从而间接得到了证明。这种有高度特异的亲和机制促使Hp能克服胃粘膜上皮的不断代谢更新过程,而继续在新生的粘膜上皮上定居寄生。然后可能再通过其生产的细胞毒素及尿素酶直接和间接作用,造成胃粘膜上皮的局部病损。

Hp表面出现有规则的突起、在CF、AS中已有报道,Kist认为是菌体外膜蛋白层的组成部分,而Winter认为是微荚膜。光镜下所见Hp的微荚膜样结构可能就属之。McCoy认为这类结构具有抗吞噬作用。但我们将Hp加入新鲜抗凝人血作吞噬实验,发现Hp很容易被吞噬。这亦可使胃上皮细胞对其有吞噬作用得到解释。从目前观察到的慢性胃炎病人胃粘膜活检中出现的一些主要特异性组织病理学表现,例如炎性细胞的浸润和渗出等,很可能是因Hp在胃粘膜上皮细胞上粘附或被上皮细胞及炎性细胞吞噬后释放的趋化因子所引起,至于Hp是否有其他致病因子,尚待进一步研究。