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人二倍体细胞建株、检定及制备疫苗规程

人二倍体细胞株来源于正常人胎儿组织,主要用于培养病毒制备疫苗等。

[B]A细胞株的要求[/B]

用于疫苗生产的人二倍体细胞株(以下简称细胞株)须按下列规定进行全面检定。新建立细胞株,应按《新生物制品审批办法》进行审批。

1 建立细胞株必须具备下列资料

1.1 建立细胞株所用的胎儿的胎龄和性别,中止妊娠原因。

1.2 建立细胞株所用胎儿的父、母年龄、职业及健康状况,胎儿父、母系三代应无明显遗传缺陷和肿瘤疾病历史。在取胎儿组织时,应作出详细调查,报卫生部审批前,应进行一次重复调查。

1.3 原始组织种类,原代培养的数量与生长状况。

1.4 细胞培养史和生长特征,细胞寿命、世代数。

1.5 细胞生长液的成分。

2 细胞株的检定

2.1 染色体的鉴定和制片

细胞原系建株过程,每8~12世代*应作一次染色体检查,一株细胞整个生命期内连续培养过程中,至少应有4~5次染色体检查结果。

每次染色体检查,应从同一世代不同细胞培养瓶中取细胞混合再培养,制备染色体标本片。染色体标本应长期保存(直至褪色不能用为止),以备复查。

每次染色体检查,至少应随机取1000个分裂中期细胞,进行染色体数目、形态和结构检查,并作出有助于复查的记录,其中至少选择50个分裂中期细胞进行显微照相,作出核型分析。并应粗数500个分裂中期细胞,检查多倍体的发生率。

可以G分带或Q分带技术检查50个中期细胞染色体带型,应用照相图片作出带型分析。以显带技术检出的核型异常(假二倍体、倒位、易位等)发生率应用比现用上限更宽的基本数据进行评价,合格上限尚未定出。

2.1.1 合格要求

1000个和500个中医细胞标本中,检查异常率、合格的上限(可信限95%,Poison法)如表1。

表1

异常检查细胞数(个)
1000500100
染色单体和染色体断裂47268
结构异常17102
超二培性852
亚二倍性*1809018
多倍性**30174

*亚二倍性超过上限时,可选用批标本片重数

**+一个中期细胞内超过53条染色体即为一个多倍体

2.1.2 染色体制片要求

应及时进行制片质量检查,如发现细胞堆积,染色体分散不好等,由于技术原因不适于读片时,可以及时重新制片。但已经读片后,不断因某项超过标准(亚二位性除外)而废弃不算。如考虑到制片技术与质量问题,可重试两次,当有一次结果与原结果相近时,又无可知原因,应以原结果为准。

2.2 外源因子检查

细胞株不应有细菌、霉菌、支原体和病毒等污染。每8~12世代细胞培养物,应进行下列检查。

2.2.1 细菌、霉菌、支原体检查

按《生物制品无菌试验规程》进行。

2.2.2 病毒检查

2.2.2.1 细胞直接观察及红细胞吸附试验

取混合瓶细胞样品,接种小瓶或小管,长成单层后更换维持液,观察2周,镜检细胞,应保持正常形态特征。培养7天,用0.2%~0.5%鸡和豚鼠混合红细胞悬液进行红细胞吸附试验,先置于4~8℃,后置于20~25℃,各30分钟,两次观察结果均应为阴性。

2.2.2.2 细胞培养检查

细胞培养的上清液混合样品,至少接种4种细胞(原代人肾或猴肾细胞、原代兔肾细胞、人源传代细胞和另一批人二倍体细胞)。接种的样品量应占维持液的20%以上,于培养5~7天和14天时,进行红细胞吸附试验(见2.2.2.1项)。培养7天的上清液在同种细胞培养上盲传一代,观察14天,应无细胞病变,红细胞吸附试验应为阴性(在该试验的细胞维持液中,允许加入少量该细胞培养用的牛血清,以利细胞维持和观察)。

2.2.2.3 动物试验检查

用乳鼠、成鼠、家兔、豚鼠和鸡胚各一组。每组动物或鸡胚接种受检细胞不应少于107。按表2所列要求进行试验和观察。如80%以上动物和鸡胚健存,此试验为通过。

2.2.2.4 其他检查

细胞株传代过程中,至少于2个不同世代水平进行包涵体、乙型肝炎表面抗原及电镜检查,结果均应为阴性。

2.3 肿瘤原体检查

每8~12世代做一次细胞株的异种移植试验,观察细胞株有无致肿瘤性质,每次实验使用6只乳鼠(3~5日龄)或体重8~10g小白鼠,经抗胸腺血清(ATS)处理,皮下接种活二倍体细胞(最适传代的细胞),观察14天,检查有无结节形成。有结节或可疑病灶时,做病理切片检查。试验同时,用HeLa或其他人源传代细胞系做阳性对照试验,用动物数与处理方法同试验组,接种被检二倍体细胞数应为对照肿瘤细胞数的5倍以上。结果二倍体细胞株不应有移植瘤形成,而对照组细胞则应有80%或更多的动物有典型移植瘤出现(肿瘤结节需经病理组织学诊断)。

表2

动物组别要求动物或鸡胚数接种途径接种细胞悬液量
(ml/只)
观察天数结果
乳鼠24小时内2窝≥10脑内
腹腔
0.01
0.1
21应健存
成鼠12~14g10脑内
腹腔
0.03
0.5
21应健存
豚鼠350~500g5腹腔5.042应健存,解剖无结核病变
家兔1.5~2.5kg5皮内
皮下
0.1×10**
9.0
21无异常
健存
鸡胚9~11日龄10尿囊腔0.23~4尿液血凝试验阴性***

*豚鼠于注射前及观察4周作旧结核菌素试验,应为阴性

**每只于背部皮内注射10处,每处0.1ml

***应用豚鼠和鸡混合红细胞作直接血凝试验

可以用任何以免疫抑制剂处理,并对肿瘤细胞有同样敏感性的其他动物试验,如无胸腺小白鼠(nude nu/nu基因型等)。

3 细胞种子

细胞株传代过程的早期,应选定适应世代数培养出大量细胞,制成悬液,分装安瓿作为细胞种子。置液氮中冻存,以备细胞株建成后,大量供应细胞。

冻存的种子细胞活存率应在60%以上。冻存后一定时间,应至少复苏培养一系至衰老期,并在不同传代水平,检查细胞株的生长、胞核学特征、异种移植等,证明细胞经冻存后的生物学性质无明显改变。

[B]B二倍体细胞用于疫苗生产的要求[/B]

1 细胞

1.1 细胞株

用于疫苗生产的细胞株,必须符合本规程要求。不含外源因子、核型正常、对病毒敏感和具有足够多的细胞种子。可用KMB-17、2BS等细胞株。所用细胞株均须经卫生部批准。

1.2 细胞种子批

一个细胞种子批应有足够量早世代细胞,分装安瓿保存于液氮中,作为细胞种子。

2 生产用细胞种子批

用一个或数个细胞种子安瓿传代增殖到适宜世代,具有一定量的均一细胞悬液,分装安瓿,标明世代、安瓿号和冻存的日期,保存于液氮中,作为生产用细胞种子。

2.1 生产用细胞种子批检定

2.1.1 细菌、霉菌、支原体检查

按《生物制品无菌试验规程》进行。

2.1.2 动物和鸡胚检查外源因子

用生产用细胞种子世代水平或至2/3世代寿命水平的细胞作检定样品。用下列动物和鸡胚检查:

乳鼠(24小时内)2窝最少10只
成鼠12~14g10只
豚鼠350~500g5只
家兔1.5~2.5kg5只
鸡胚9~11日龄10只

各种动物和鸡胚的接种法、观察期,按照A2.2.2.3条进行。

2.1.3 肿瘤原性检查

按A2.3项执行。

2.1.4 染色体的监测

检查用于生产的最后一个世代或其后任一世代,至少检查500个中期细胞的多倍性、染色体精确计数、断裂率、结构异常及其他异常发生率,例如螺旋消失或初级次缢痕或次级次缢痕的明显减弱等。按A2.1.1项进行评价。

生产用细胞库细胞染色体监测用的染色体标本片和照片,应作为该细胞批监测此细胞生产疫苗批的记录,永久保存。

3 生产用细胞的培养

3.1 从生产用细胞种子开始传代培养,以适宜分种率连续传代,直至增殖足够量的细胞培养物用于生产。用于生产的细胞世代,应在细胞整个寿命期的前2/3世代内。

3.2 细胞外源因子检查

于种毒当天,或在连续传代种毒,于最后一次细胞种毒当天,此批细胞留取2%~5%不种毒,换维持液作为正常细胞对照,以检查外源因子。从换液之日起观察2周,细胞应无异常变化。

用换维持液0~2天的对照细胞上清液,接种原代兔肾、非人灵长类传代细胞及另一批人二倍体细胞,接种样品量应占维持液的20%。观察14天,换液后5~8天用上清液,在相应细胞盲代一代,观察14天,做血吸附试验。

在收毒时,用0.2%~0.5%鸡和豚鼠红细胞,在2~8℃和20~25℃做血吸附试验,应为阴性。

3.3 细胞鉴别试验

在生产用细胞世代水平或其后数代,检查300个中期细胞,计数多倍体,作100个中期细胞染色体检查,应核型正常,鉴别确为本细胞无误。

除染色体监测外,还可用HLA表面抗原鉴定试验。

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*细胞“世代”的说明:英文是“Population doubling”,简写“PD”,译成“群体培增”,为通俗和习惯以名词“世代”来表示。PD可按实际计数,增加一倍,或按细胞培养面积,增加一倍,为一个PD,即一个世代。也就是细胞以1:2分种率传代则为一个世纪,以1:4分种率传代则为2个世代,1:8分种率传代则为3个世代。

 

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