第三节　免疫酶细胞化学技术

一、基本原理

免疫酶细胞化学技术是以酶作为抗原抗体反应的标记物，在既不改变抗原抗体的免疫反应特异性也不影响酶活性的条件下，与相应的酶底物作用，形成一种不溶性的反应产物。在光学显微镜下观察时，要求反应的终末产物是不溶性的有色物质，具有可观察性。在电镜下观察时，则要求底物的终末产物具有较高的电子密度。由于辣根过氧化物酶（Horse Radish Peroxidase, HRP）具有稳定性强和反应特异性高等优点，是目前应用最多的酶标记物。实验方法包括酶标记抗体法、非标记抗体酶法和非标记的过氧化物酶—抗过氧化物酶技术（即PAP法，见第四章　）。

二、电镜标本制备方法

免疫酶细胞化学技术可用于包埋前和包埋后染色，但以前者应用较多。

1．单层细胞培养物免疫酶染色法

（1）用4%多聚甲醛（在0.05mol/l 磷酸缓冲液中，pH7.2）在原位固定（4^℃）1h。

（2）用0.05mol/l PBS充分洗涤后，用HRP标记的抗体血清作用18h，再用PBS充分洗涤。

（3）2%戊二醛固定1h，再水洗。

（4）呈色反应，用DAB—H₂O₂呈色反应，水洗。

（5）1%锇酸后固定30min～1h，原位用环氧树脂包埋，光镜作半薄切片定位，作超薄切片。

2．组织切片酶标记抗体染色法

（1）1mm厚组织块，在4^℃下用固定液固定后，置于含4.5%的蔗糖PBS（0.05mol/l pH7.2），4^℃中漂洗，换数次固定液，过夜。

（2）随后，作10～40μm的冰冻切片，放入第一抗体血清作用12～18h，4℃，用含蔗糖的PBS洗数次。

（3）置于HRP标记抗体液（第二抗体）4^℃过夜。然后用4℃含蔗糖PBS反复冲洗数次。4^℃浸漂过夜。

（4）2.5%戊二醛（pH7.4磷酸缓冲液）再固定1h，4^℃用含蔗糖PBS反复冲洗去戊醛，每次5min，共洗3次。

（5）DAB-H₂O₂显色15～30min。

（6）0.05mol/l PBS冲洗3次，每次30min，再置于室温中用1%～2%锇酸固定1h，脱水、包埋、切片复染和观察。

3．PAP包埋前染色法（Pickel 等，1975）

经固定组织、应用振动切片机（Vibratome）切35～50μm厚片，或用组织铺片，以漂浮法在反应板上进行下列步骤：

（1）正常羊血清（1：30PBS稀释），室温孵育30min。

（2）第一抗体（A种动物抗血清），4℃湿盒中48～72h。

（3）羊抗A种动物血清（1：100）室温30min。

（4）A种动物血清PAP复合物（1：100）室温30min。

（5）DAB·4HCl/H₂O₂(0.05%/0.01%)，室温1.5min。上述每一步骤后应用PBS洗涤（5min×3次）。

（6）在解剖显微镜下检出免疫反应阳性部位，修整组织，用0.1mol/L磷酸缓冲液稀释的1%锇酸（pH7.4）后固定30min～1h。

（7）按常规电镜样品制备，脱水、包埋、超薄切片、染色观察。

4．PAP包埋后染色法（Ordronneau, 1982）

（1）将载有切片的镍网（或金网）在5%的H₂O₂液中蚀刻（etch）2～3min。生理盐水冲洗，滤纸吸干。

（2）正常羊血清用0.05mol/L Tris盐液（TBS）稀释成1：30，pH7.0，室温5min 。

（3）兔抗血清（第一抗体），内含1%正常羊血清，用0.05%mol/l Tris缓冲液稀释，pH7.6,4℃，48h后以Tris缓冲液洗涤。

（4）正常羊血清1：30，室温5min。

（5）羊抗兔1：10（第二抗体，0.05mol/l Tris缓冲液稀释，pH7.0），室温5min，Tris缓冲液洗涤。

（6）正常羊血清1：30，室温5min。

（7）兔PAP复合物，内含1%正常羊血清，室温3min,Tris 缓冲液洗涤。

（8）DAB—H₂O₂液显色（含H₂O₂0.01%～0.03%）,室温3min。

（9）4%的磷酸盐缓冲的锇酸溶液10～15min，蒸馏水洗涤（此步用于改善微细结构的反差），电镜观察。

5．PAP免疫电镜双重标记

在连续的超薄切片上进行，用包埋后染色法在相邻的两张切片上分别以不同的抗体进行免疫染色。可在超威结构水平判定细胞内抗原共存的情况。